Clostridium acetobutylicum is one of the promising organisms for biofuel industry. Metabolic redesigning studies for production of butanol in C. acetobutylicum have been carried out. For this study, metabolic pathways of C. acetobutylicum including acid synthesis pathway, acid reassimilation pathway and solvent synthesis pathway have been redesigned to support butanol production.
At first, metabolic redesigning of C. acetobutylicum was carried out for enhanced butanol production.
Various genes involved in the dissimilation and reassimilation pathway of acetic and butyric acids in C. acetobutylicum were engineered to evaluate their impact on solventogenesis by measuring the fermentation products as well as by metabolic flux balance analysis. Disruption of pta gene encoding phosphotransacetylase on the acetate dissimilation pathway was particularly outstanding in enhancing butanol production. The pta-deficient C. acetobutylicum EKW was able to produce 18.5 g/L butanol as compared to 13.0 g/l butanol production in parent strain. In the next strategy, both the pta and buk genes were simultaneously disrupted to produce C. acetobutylicum BEKW strain capable of producing a maximum of 16.8 g/L butanol. Although, complete removal of acetic and butyric acid production could not be achieved in BEKW, phase transition from acidogenesis to solventogenesis was triggered earlier in BEKW as compared to both the parent and EKW strains. Phase transition was observed in just 6.3 h in BEKW as compared to more than 9.0 h in the other two strains. During the study on acid reassimilation pathway, it was found that acetate production pathway is not a reversible reaction in C. acetobutylicum. It was also observed that butanol could be produced from surplus acetyl-CoA via butyryl-CoA with butyrate dissimilation and reassmilation in EKW strain.
Secondly, a possible way to improve the economic efficacy of acetone-butanol-ethanol fermentation is to increase the butanol selectivity by eliminating the production of other by-products, such as acetone. For selective butanol production C. acetobutylicum M5(pIMP1E1ESL) was constructed by adhE1-groESL co-expression of C. acetobutylicum M5, a derivative strain of C. acetobutylicum ATCC 824, which does not produce solvents due to the lack of megaplasmid pSOL1. It was constructed pIMP1E1ESL cloned aad gene encoding aldehyde/alcohol dehydrogenase (AAD) and groESL gene encoding for groES and groEL chaperone protein. The batch fermentation studies showed that co-expression of aad and groESL restored 8.5 g/L butanol and 1.8 g/L ethanol formation in mutant M5 and suppressed production of acetone absolutely.
Thirdly, Clostridium acetobutylicum M5(pIMP1E1AB) was constructed by adhE1-ctfAB complementation of C. acetobutylicum M5. The gene products of adhE1-ctfAB catalyze the formation of acetoacetate and ethanol/butanol with acid re-assimilation in solventogenesis. Effects of the adhE1-ctfAB complementation of M5 were studied by batch fermentations under various pH and glucose concentrations, and by flux balance analysis using a genome-scale metabolic model for this organism. The metabolically engineered M5(pIMP1E1AB) strain was able to produce 11.1 g/L (154mM) butanol with 0.6 g/L (9.9mM) acetone at pH 5.5, resulting in a butanol selectivity (a molar ratio of butanol to total solvents) of 0.84, which is much higher than that (0.57 at pH 5.0 or 0.61 at pH 5.5) of the wild-type strain ATCC 824. Unlike C. acetobutylicum ATCC 824, higher level of acetate accumulation was observed during fermentation of M5 strain complemented with adhE1 and/or ctfAB. A plausible reason for this phenomenon is that cellular metabolism was shifted towards acetate production in order to compensate reduced ATP production during the largely growth-associated butanol formation by the M5(pIMP1E1AB) strain.
Finally, the acetoacetate decarboxylase gene(adc) in C. acetobutylicum ATCC824 was disrupted for highly selective butanol production. The butanol ratio increased from 66% to 88%, with acetone production reduced to approximately 0.50 g/L in the adc-disrupted mutant (AdKW).Also AdEKW disrupted both the pta and adc genes and AdBEKW strain, the triple knockout mutant, disrupted the pta, buk and adc genes simultaneously were constructed for the production of highly selective butanol. Although, complete removal of acetic and butyric acid production could not be achieved, acetic and butyric acid production ratio was lowed and acetone production was suppressed simultaneously. Butanol ratios of AdEKW and AdBEKW were 82% and 88%, respectively.
클로스트리듐 아세토부틸리쿰은 바이오연료 산업에 있어서 기대되는 미생물 중 하나이다. 이번 연구를 통해 부탄올 생산을 위하여 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 대사를 재설계하였다. 이러한 대사재설계는 부탄올 생산에 영향을 주는 산 생합성 경로와 동화경로, 용매 생합성 경로 등의 대사공학을 포함한다.
첫째로 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 부탄올 생산을 증대시키기 위한 아세트산과 부틸산의 대사경로 재설계를 수행하였다. 이를 통해 용매생합성에 미치는 각 대사 flux의 영향을 연구하고자 하였다. 결과적으로 아세트산 생합성과 관련한 phosphotransacetylase를 코딩하고 있는 유전자가 유실되었을 때 부탄올 생산이 상당히 증가함을 밝혔다. 야생형 균주가 부탄올을 13.0 g/L 생산하는 것과 비교하여 이러한 pta-결실 균주인 EKW는 18.5 g/L 부탄올을 생산하였다. 이후 이 균주에 부틸산 생합성과 관련한 buk gene을 결실시켜 EKW 또는 야생형 균주 보다 산생성기에서 용매생성기로 전환하는 속도가 1.5배 빠른 pta와 buk가 동시에 결실된 균주인 BEKW를 제조하였다. 이 연구를 통해 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 pta를 결실시킨 경우 아세트산의 생합성 반응은 비가역적으로 일어나며 따라서 부탄올 생합성은 과잉의 아세틸 coA가 부틸 coA로 전환하여 합성되거나 또는 부틸산의 이화과정 또는 재 동화과정을 통해 생산될 수 있음을 알 수 있다.
둘째로 부탄올의 경제효율성 있는 생산을 위해 선택적으로 부탄올을 생산하기 위한 클로스트리듐 대사재설계를 수행하였다. 연료로서 가치가 적은 아세톤의 생산을 처음부터 배제시키기 위하여 아세톤-에탄올-부탄올을 동시에 생산 가능하도록 하는 sol 오페론이 포함되어있는 거대플라스미드가 제거된 돌연변이 균주, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5를 이용하였다. 이 균주에 알코올-알데하이드 탈수소효소와 샤페론 단백질로 잘 알려진 groES와 groEL을 코딩하고 있는 유전자를 발현시킴으로써 아세톤 생산이 전혀 없이 8.5 g/L 부탄올와 1.8 g/L 에탄올을 생산하였다.
셋째로 위에서 설명한 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5 균주에 알코올- 알데하이드 탈수소효소와 함께 CoA transferase를 코딩하고 있는 유전자, aad와 ctfA/B를 발현시킴으로써 야생형 균주와 유사한 수준의 부탄올을 아세톤 생산을 1g/L 이하로 낮추면서 동시에 생산하였다. 이 균주 M5(pIMP1E1AB)는 다양한 pH와 초기 포도당 농도를 달리하여 회분식 배양을 최적화하였다. 결과적으로 이 균주는 pH를 5.5 이상으로 유지 할 때 아세톤 0.6g/L (9.9 mM)와 함께 11.1 g/L (154 mM) 부탄올을 생산하였다. 반면 초기 포도당 농도는 부탄올 생산에 영향을 주지 않았다. 이 균주는 총 용매생산에 대한 부탄올 선택성이 0.84 (mol/mol)로 야생형 균주가 0.61인 것과 비교하여 매우 높다. 그러나 M5(pIMP1E1AB)는 야생형 균주와 달리 부탄올 생합성 과정과 동시에 아세트산의 축적을 나타내었다. 이러한 현상은 M5(pIMP1E1AB)의 세포성장과 연관하여 부탄올을 생산하는 과정에서 감소된 ATP 합성을 보상하기 위하여 아세트산을 합성하는 것으로 보여진다.
마지막으로 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC824, 야생형 균주로부터 아세톤 합성에 관련한 효소인 아세토아세테이트 탈탄산효소를 코딩하고 있는 유전자, adc를 결실시킴으로써 선택적인 부탄올 생산을 유도하였다. 이 균주 AdKW의 부탄올 생합성 비율은 야생형 균주가 66% (w/w) 인 것에 비해 88%로 증가하였다. 또한 아세톤 대사경로와 아세트산 대사경로가 동시에 저해된 pta, adc 결실 균주 AdEKW와 아세톤, 아세트산과 부틸산 대사경로가 동시에 저해된 pta, buk, adc 결실 균주 AdBEKW를 제조하였다. 이러한 균주는 M5(pIMP1E1AB)와 마찬가지로 아세트산의 축적이 나타난 AdKW와 달리 아세트산의 최종 생산 농도가 현저히 감소되었고, 또한 총 용매에 대한 부탄올 생산비율은 각각 82%와 88%로 야생형보다 높게 유지되었다.
