For the kinetic analysis and for the stable maintenance of plasmid in a recombinant cell culture system, two-stage continuous culture was performed using a mutant of $\underline{E}$.$\underline{coli}$ W3110 $\underline{trp}LD$ $\underline{trp}R^{ts}$ $\underline{tna}^-$/pCRT185 carrying trp operon.
In the first stage at 37℃, the plasmid was stably maintained for more than 200 hrs because the cloned genes were not expressed at this repressed condition. In the second stage at 42℃, the cloned genes were expressed highly and the plasmid stability was maintained at 100% as far as the plasmid stability in the first stage was maintained.
As a result of the stable maintenance of plasmid in the second stage, the specific production rate of L-tryptophan, $q_p$, was maintained constantly in second stage. The $q_p$ was influenced mainly by the specific growth rate of cell population in the second stage, $μ_2$, and was the highest (4.2mg L-tryptophan/g-cell?hr) at $μ_2$=0.011 $hr^{-1}$. The plasmid content was increased from 0.05 to 0.4 mg-DNA/g-cell as the $μ_2$ was decreased from 0.277 to 0.011 $hr^{-1}$. But the expression efficiency of the plasmid-coded gene was increased from 11 to 77 mg L-tryptophan/mg-DNA?hr as the $μ_2$ was increased from 0.011 to 0.277 $hr^{-1}$.
The relative content of plasmid-coded tryptophan synthetase enzyme per cell was decreased from 100% to 46% as the $μ_2$ was increased from 0.011 to 0.277 $hr^{-1}$.
재조합 미생물내에 cloning된 유전자의 발현시 안정한 유지상태와 유전자 발현에 관한 속도론적 연구를 위해 2단계 연속 배양을 수행하였다. 이를 위해 37℃ 에서는 trp operon 의 발현조절기능을 가지나, 42℃ 에서는 이 조절기능을 잃어 버리는 변이주, 즉 E.coli $W3110 \triangle trpLD\; trp^{ts}tna^-/ pCRT185$ 를 사용하였다.
37℃인 첫번째 발효조 에서는 세포성장은 왕성하나 유전자 발현이 억제상태에 있으므로 tryptophan이 아주 낮게 생성되었고 또한 재조합된 plasmid 의 안정성은 200 시간 넘게 100% 로 유지되었다. 그러나 42℃인 두번째 발효조에서는 세포가 위의 조절기능을 잃어버려, 유전자가 아주 높게 발현되었다. 또한 훨씬 증가된 유전자 발현상태임에도 불구하고 plasmid 의 안정성은 첫번째 발효조에서 넘어온 세포 내의 plasmid안정성이 감소 하지 않는한 100% 수준을 유지하였다.
두번째 발효조에서 세포의 plasmid안정성이 높은 상태로 계속 유지되므로 두번째 발효조 내의 생성되는 tryptophan 양이 일정하였고, tryptophan 비생산속도( $q_p$ ) 값도 일정하게 유지되었다. 그리고 $q_p$ 는 두번째 발효조의 세포군의 비성장속도($\mu_2$)에 의해 크게 영향을 받았으며, $\mu_2= 0.011 hr^{-1}$ 일때 4.2 mg L-Tryptophan/g-cell·hr 로 최고값을 나타내었다. Plasmid량은 $\mu_2$가 0.277 에서 $0.011 hr^{-1}$로 감소함에 따라 0.05 에서 0.4 mg-DNA/g-cell 로 증가하였다. 또한 plasmid에서 coding된 세포당 tryptophan synthetase enzyme 의 상대적인 량은 $\mu_2$가 증가할수록 100%에서 46% 로 감소하였다.
그러나 plasmid-coded gene expression efficiency 는 $\mu_2$ 가 증가할수록 11 에서 77 mg L-tryptophan/mg-DNA·hr 로 증가 하였다.
따라서 재조합 미생물의 $q_p$ 는 낮은 성장속도에서는 gene dosage 에 의해 영향을 받으나, 높은 성장속도 에서는 cell의 증가된 biosynthetic activity에 크게 영향을 받음을 보였다.
