A set of new restriction endonuclease, Cth I, Cth II, is isolated from Clostridium thermocellum ATCC27405 by the following steps: ammonium sulfate fractionation, DEAE-cellulose, phosphocellulose (P-11) column chromatography. Restriction endonuclease, CthI cleaves neither pUC9 nor pBR322 plasmid DNA, while it cleaves SV40 and T7 DNA at one site, Adeno2 DNA at five sites, bacteriophage lamda DNA at eight sites. Restriction endonuclease, CthII, cleaves M13 DNA at two sites, bacteriophage lamda DNA at seventy one sites, Adeno2 DNA at one hundred thirty six sites. The restriction enzyme, R-CthI shows maximum activity at pH 9 to 11, 0 mM Nacl, 2 to 20 mM $Mg^{++}$ and 65℃. Restriction enzyme, R-CthII shows maximum activity at pH 8 to 9, 0 mM NaCl, 10 to 20 mM $Mg^{++}$ and 55℃. Restriction endonuclease, Cth II recognize the same sequence as Bcl I 5'-TGATCA-3' and the restriction endonuclease, Cth II recognize the same sequence as BstN I, EcoR II, Zan I $5'-CC^A_TGG-3'$.
Type II 제한효소 및 변형효소는 크기가 작고, 안정하며, 효소의 활성화를 위하여 요구하는 것이 간단하고, DNA 이중 나선상에서 염기서열을 특이하게 인식하는 성질을 보이고 있어서, 분자생물학에 있어서 해명하여야 할 과제의 하나인 DNA 와 단백질간의 상호작용을 연구하는데 이상적인 모델로 이용되어 왔다. 한편, Type II 제한효소 및 변형효소는 DNA 상에서 특이한 염기서열 인식능력 때문에, 재조합 DNA 연구에 유용하게 이용되고 있으며, 최근에는 특히 변형효소가 eukaryotes의 유전자 expresstion 연구에 이용되고 있다.
본 실험에서 Type II 효소에 대한 연구의 하나로 박테리아인 Clostridium thermocellum 으로부터 새로운 제한효소를 분리하여 이 효소들의 Catalytic properties와 인식부위의 염기서열에 대해 분석하였다.
새로운 Cth I, Cth II endonuclease는 Clostridium thermocellum ATCC 27405 cell로부터 $(NH_2)SO_4$ 분획침전, DEAE-cellulose (A-50), phosphocelluose (P-11) column chromatography를 하여 분리하였다.
이렇게 분리된 Cth I 제한효소는 박테리오파아지 lamda DNA에 8개, SV 40와 T7 DNA에 1 개, Adeno 2 DNA 에 5 개의 절단부위를 가지고 있다. Cth I 제한효소 활성에 미치는 여러가지 인자의 최적조건은 다음과 같다:
10 mM glycine-NaOH, pH 10.0, 10 mM $MgCl_2$, 0 mM NaCl and 65 C.
Cth I 제한효소의 인식부위의 염기서열을 분석한 결과, 이 Cth I 제한효소는 다음과 같은 염기서열을 인식한다.
5' - T G A T C A - 3'
3' - A C T A G T - 5'
이러한 인식부위는 Bcl I 제한효소(of Bacillus caldolyticus) 의 그것과 같음으로써 Cth I 제한효소는 Bcl I 제한효소와 isoschizorner 임을 밝혀냈다.
Cth II 제한효소는 박테리오파아지 lamda DNA에 71개, Adeno 2 DNA에 136개, M 13 DNA에 2개의 절단부위를 가지고 있다. 그리고 Cth II 제한효소 활성에 미치는 여러가지 인자의 최적조건은 다음과 같다.:
10 mM Tris/ HCl, pH 9.0, 10 mM $MgCl_2$, 0 mM NaCl, and 60 C.
Cth II 제한효소의 인식부위의 염기서열을 분석한 결과, 이 Cth II 제한효소는 다음과 같은 염기서열을 인식하고 화살표가 가르키는 곳을 자른다.
5' - T $^{\downarrow}G$ (A) T C A - 3'
3' - A C (T) A $G_{\uparrow}$ T - 5'
이러한 인식절단부위는 BstN I 제한효소 (of Bacilus steanothermophilus N)의 그것과 같음으로써 Cth II 제한효소는 BstN I 제한효소와 isoschizomen 임을 밝혀냈다.
