Activities of restriction endonucleases for methylated DNAs by type II restriction methylases in vitro were observed. The cleavage reactions of Sma I, Ava I and Nae I endonucleases were inhibited completely by the methylation of Hpa II methylase but was greatly for Xma I endonuclease. Also the methylation of Hha I methylase inhibited the cleavage reactions of Hae II and Aha II endonucleases completely, greatly for Nar I but not influenced any apparent activity for Ban I. To analyze the cleavage reactions, pDR323 plasmid (323 base pairs of Pvu II fragment was deleted from pUC9), M13mp9 RF and tritium labeled pUC9 plasmid DNAs were used. The degree of the inhibitions against cleavages by the endonucleases were measured. The results imply the specificities of the related hexameric restriction methylases which have not been isolated yet. And now, one could use these tetrameric restriction methylases in gene manipulations instead of related hexameric methylases. Also from above results, specific nicks could be introduced at the site in which a restriction endonuclease was inhibited greatly. Specific nicks are useful in sequence analysis and site specific mutagenesis. Additionally Aha II endonuclease was inhibited by the methylation of one external cytosine in recognition sequence.
4 개의 뉴클레오 타이드를 특이하게 인식하여 특정 염기를 에틸화 시키는 변형효소 Hpa II와 Hha I 으로 여러가지 DNA 들을 변형시켰다. 변형효소 Hpa II 는 DNA의 CCGG 를 인식하고 안쪽의 C 를 메틸화 시킨다. 이렇게 변형된 DNA 에 제한효소 Sma I, Xma I, Ava I 그리고 Nae I을 각각 처리한 결과 Sma I, Ava I, Nae I 은 전혀 활성을 보이지 않았으나 Xma I 은 매우 낮은 활성을 보였다. 또 변형 효소 Hha I 에 대하여는 아주 다양한 결과를 보였다. 제한효소 Hae II, Aha II는 변형된 DNA 에 대하여 활성이 완전히 저해 되었고 Nar I 은 매우 심하게 저해를 받았으나 Ban I 에 대해서는 효소 활성에 전혀 영향을 미치지 않았다.
이런 결과들로 부터 다음 몇 가지의 사실들을 알아 낼 수 있었다. 첫째, 제한 효소에 대응하는 아직 발견되지 않은 변형효소의 DNA 인식 부위에서 메틸기를 전달하는 특정 염기가 어느 것인지를 간접적 으로 예견할 수 있었고, 둘째, 아직 분리되지 않아 이용 할 수 없는 변형 효소를 대체할 수 있는 효과를 얻을 수 있어 특히 링커를 이용한 유전자 클로닝에 유용하게 사용할 수 있게 되었다. 셋째, 변형된 DNA를 매우 느린 속도로 절단하는 제한효소를 이용하여 특정 부위에 니크를 만들 수 있어 염기서열 분석및 특정 부위의 돌연변이 연구에 이용될 수 있을 것이다. 또한 DNA 와 단백질의 상호 작용에서 단백질이 인식하는 DNA 염기상의 위치를 간접적으로 알수 있었고 각 제한효소의 독특한 성질을 관찰할 수 있었다.
