$\underline{Eco}$ RI, mostly investigated Type Ⅱ restriction endonuclease, is a phosphodiesterase that hydrolyses the phosphodiester bond of DNA. But, very little is known about the chemical steps involved on the cleavage of the scissible phosphodiester bond. In this research, with both the plasmid DNA and λ bacteriophage DNA as substrates, specific reaction mode of $\underline{Eco}$ RI as a phosphodiesterase for double stranded DNA was surveyed.
Enzyme activity was chiefly traced either by film scanning technique followed by the separation of product DNA fragments in agarose gel electrophoresis, or accompanied by newly developed assay method using the HPLC(High Performance Liquid Chromatography) system employed gel permeation column. Simplicity, high sensitivity good reproducibility, and safety are the peculiar advantages of this assay system.
It was found that the cleavage of both strands of the duplex DNA was achieved only after two independent phosphodiesterase actions for single strands, which were thought as the same reaction for both the first and the second cleavage. Say, closed circular form DNA was changed into linear form DNA through the intermediate open circular form DNA, and the intermediate form was more accumulated when the condition was more deviated from the optimal state: It was thought that the intermediate was dissociated from the enzyme and this was the transient product of single turn-over of the enzyme.
A proposed model mechanism of the above phosphodiesterase action for double stranded DNA by $\underline{Eco}$ RI restriction endonuclease was suggested from the study of chemical modification and pH-activity relationship through the identification of ionizable groups at the active site of the enzyme. In the chemical modification study, enzyme inactivation by Iodoacetamide and Diethyl pyrocarbonate, and by Diisopropyl fluorophosphate suggested that Histidine and Serine residue of the enzyme were directly involved in the prototropic groups at the active site of $\underline{Eco}$ RI endonuclease as a concerted acid-base catalysed process. The survey of pH-activity relationship was followed, shape difference of substrates did not affect the optimal activity of enzyme and bell-shaped profile, pH optimum pH 7.6 was identified and this fact supports the result from the chemical modification study.
Type Ⅱ 제한효소, $\underline{Eco}$ RI은 DNA 의 phosphodiester 결합을 가수분해 하는 phosphodiesterase 로서, 본 실험 에서는, DNA 의 절단에 따르는 화학적 단계를 밝히는데 중점을 두어 연구 되었다.
효소의 반응 정도는, film scanning 방법이나 형광 측정 방법, 또는 특별히 HPLC system 을 이용한 분석 방법을 선택적으로 사용하여 알 수 있었다. 이 HPLC system 에 의한 제한효소 반응의 분석은, 다른 방법에 비해, 그 간편성이나, 고도의 민감도, 재현성이 좋은 것이 주된 특징으로, 실험에는 액상의 μ-Bondagel E-linear 나 protein column 의 gel permeation chromatography column 이 이용 되었으며, 그 기질로서는, λ/$\underline{Stu}$ I (1519 bp) 의 DNA 절편이 사용 되었다.
$\underline{Eco}$ RI 제한효소는, 이중나선의 DNA 에 대해, 두 단계의 각각 같은 기작을 가질 것으로 여겨지는 단사 절단 반응을 거쳐 진행 되는 것이 확인 되었으며, 그 중간 생성물의 축적은 호조건에서 벗어 날수록 더 많이 일어나는 것으로 보아 효소로 부터 해리가 일어난 single turn-over의 결과 산물로 생각 되었다.
각 단사 절단의 기작은, 효소 자체의 화학적 변형에 의한 일방적인 반응의 방해와 pH에 대한 반응 속도의 의존성을 알아 봄으로써, 효소의 활성 부위에 있는 ion화 할 수 있는 amino 산의 잔기를 파악할 수 있어, 그로 부터 유추 할 수 있었다. $\underline{Eco}$ RI 제한효소의 화학적 변형 결과, serine 잔기의 hydroxyl 기와 histidine 잔기의 imidazole 기가 효소의 활성 부위에서, 일반적인 산-염기 촉매반응으로 직접적으로 관여 할 것이라는 예상을 할 수 있었고, pH에 대한 반응 속도의 의존성도, 최적 pH가 7.5 근처의 종 모양의 profile이 얻어져, 이 사실을 뒷받침 할 수 있었다.
따라서, 일련의 반응 속도론적 실험에 기초하여, $\underline{Eco}$ RI 제한효소에 의한 이중나선 DNA에 대한 phosphodiesterase 작용의 하나의 모델 기작을 제안 할 수 있었다.
