Complementary DNA(cDNA), transcribed $\underline{in vitro}$ from isolated bovine pituitary poly(A)+ RNA and made double-stranded, has been inserted into $\underline{E.coli}$ plasmid pBR 322 by the poly(dG)/poly(dC) tailing and annealing technique. It was observed that the size of cDNA insert from $\underline{E.coli}$ transformants revealed by agarose gel analysis was shortened during steps of tailing, annealing and transformation. To monitor the cDNA size deletion, the "internal trailing" which had been suggested as a possible reason for size deletion of insert from transformants, was investigated as follows; Nicking of 1078 base pairs long blunt-ended Ø× 174 DNA fragment digested with Hae III by treatment of DNase I, its tailing under $Co^{2+}$, annealing and transformation, then, the size of that fragment from transformants was considerably shortened also. The original size of 1078 base pairs long was reduced on the average of below the 500 base pairs long by the treatment of more than 1ul of 0.01μg/ml DNase I to ∼400ng of DNA. This result was considered to be mainly due to the internal tailing of DNA. And, it has been shown that TCA precipition method to calculate the numbers of the added nucleotides to 3'-OH termini of DNA and optimize the tailing reaction was not to be used properly to determine the tailing time point at which the maximum numbers of transformants would be obtained. In addition, the tailing reaction rate(;may be mainly internal tailing) of nicked DNA was increased when adding trivalent metal complex, $Co^{3+}(NH_3)_6$ which is known to cause the conformational change of DNA as well as $Co^{2+}$ which acts as a corfactor of terminal deoxynucleotidyl transferase.
As a result of this experiment, the points that should be somewhat improved through the tailing reaction, important in cDNA cloning, were mentioned and the possible methodology was also suggested.
소의 뇌하수체 조직으로 부터 RNA 를 분리하고 이로부터 mRNA 를 분리하여 이로부터 cDNA 를 합성하고 그 크기가 600-1000base pair 길이부분의 cDNA 를 분리하여 tailing 및 annealing 반응에 의해 pBR 322 vector에 붙인후 $\underline{E. coli}$ LE392 균주를 형질전환 시켰을 때 형질 전환균주로 부터 분리한 plasmid 의 cDNA insert크기를 확인하니 평균 500 base pair이하로 작아진 사실로 부터 tailing 및 annealing 그리고 transformation 단계를 통해 작아진 것으로 나타났다. 이러한 cDNA 크기의 감소의 원인을 조사하기 위해 $\phi$X 174RF DNA 를 Hae III 제한 효소로 blunt end 로 자른 후 그 중 1078 base pair 조각을 이용하여 이것에 DNase-I 으로 nick 을 유도시킨 후 $Co^{2+}$ 하에서 tailing 을 하고 annealing 과 transformation 후에 그 조각의 크기가 상당히 작아진 것을 확인함으로서 그 원인은 $Co^{2+}$ 첨가조건의 tailing 반응시의 DNA 의 내부 nick 에서 진행되는 internal tailing 에 의한 것임을 알 수 있었다. 즉 DNA 약 400 ng 에 0.01 μg/ml DNase I 의 1 μl 이상을 처리반응에서 그러한 결과가 나타났다. 또한 일반적으로 tailing반응조건의 최적화를 위해 TCA 침전법에 의해 DNA 의 3'-OH 말단에 첨가되는 nucleotide 수의 계산법은 실제최대 형질전환균수를 나타내는 시간과 일치하지 않았다. 그리고 tailing 반응은 $Co^{2+}$ 이온 뿐 아니라 DNA 에 구조적 변화를 주는 것으로 알려진 3가 금속이온 복합체인 $Co^{3+}(NH_3)_6$ 를 첨가 했을 때 nick 이 유도된 DNA 에서 tailing 속도 (; 주로 internal tailing)를 증가 시켰다. 따라서 본 실험결과에 의하여 tailing반응의 방법및 반응 조건등은 개선해야 할 점들이 있으며 가능한 개선방법을 언급하였다.
