In this communication, we introduced a soybean trypsin inhibitor in the reaction system to block the activities of trypsin and plasmin like proteolytic enzymes. Since STI was found to be a selective inhibitor for the other serine proteases except SK-PLG complex, in the presence of STI, we were able to quantitize the activity of the SK-PLG complex using artificial chromogenic substrate such as $N^a$-CBZ-L-lysine-p-nitrophenyl ester (CLM).
Also, with the kinetic study of SK-PLG complex for synthetic esters and peptides, its substrate specificity has been investigated. This results show that the SK-PLG complex is primarily specific for peptides and esters of N,C-blocking, N-positively charged amino acids which have hydrophobic groups at its a-carboxyl position.
Like other serine proteases, the SK-PLG complex was irreversibly inhibited by diisopropylfluorophosphate(DIFP) and diethylpyrocarbonate(DEPC) as well. So, it was concluded that the hydroxyl group of serine and the imidazole group of histine have been constituted a part of the active site of SK-PLG complex. This result was supported by pH-profile of SK-PLG complex using $N^a$-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide as a substrate.
And it was observed that the hydroylsis of CLN catalyzed by SK-PLG complex proceeds with an initial burst of p-nitrophenol release, followed by a slower steady-state release of this product. This experimental observation may provides proof that a particular covalent SK-PLG complex-substrate compound is formed as an intermediate in the reaction of SK-PLG complex. This, based on these results investigated, reaction mechanism of SK-PLG complex can be proposed.
Also some human plasma proteins, carbonate ion, and chloride ion, etc. affected the activity of SK-PLG complex. It was considered that these components in human blood may be partially concerned in the regulation of blood fibrinolysis related to the SK-PLG complex.
Urokinase와 더불어 혈전증 치료제 및 소염제로 널리 이용되고 있는 streptokinase는 다른 단백분해효소와는 달리 그 자체로는 활성을 나타내지 않고 단지 human plasminogen과 활성 복합체를 이룸으로써 혈액내의 용혈 현상에 관여하는 것으로 알려지고 있다. 본 논문에서는 이러한 SK-PLG 복합체의 기질 특이성과 반응 기작을 밝히고자 하였다.
CLN 과 같은 작은 크기의 기질을 사용시, STI 가 plasmin 이나 trypsin 과 같은 효소들에만 선택적으로 작용하는 억제제로 밝혀졌기 때문에 이 억제제를 사용하여 streptokinase와 plasminogen의 농도에 관계없이 모든 조건에서 SK-PLG복합체만의 활성을 정량적으로 측정할 수 있었다. 이러한 억제제 존재하에서 여러 합성 기질을 사용해 SK-PLG 복합체의 기질 특이성을 조사해 본 결과, 반응 작용부위의 N-말단잔기 위치에 Lys, Arg, 또는 His과 같은 양성 전하를 띤 아미노산이 존재할 수록, C-말단잔기 위치에는 비교적 커다란 소수성기가 존재할 수록 보다 좋은 기질로 작용할 수 있다는 것을 알 수 있었다. SK-PLG복합체의 활성은 DIFP 와 DEPC 등에 의해 비가역적으로 완전히 억제됨을 관찰함으로써 Ser의 hydroxyl 기와 His 의 imidazole기가 SK-PLG 복합체의 활성 발현에 기능단으로 작용한다는 사실을 알 수 있었으며 이러한 결과는 SK-PLG 복합체의 pH-profile에 의해 보다 확실하게 증명할 수 있었다. 또한 "initial burst" 현상이 관찰됨으로써 SK-PLG 복합체와 기질인 CLN이 반응 도중에 acyl 중간체를 형성한다는 사실을 간접적으로 증명할 수 있었다. 한편 혈액내에 존재하는 $CO_3^{-2}$ 이온은 SK-PLG 복합체의 활성을 보다 증가 시켜 준 반면 $Cl^-$ 이온의 경우, 농도를 증가시킴에 따라 SK-PLG 복합체의 활성이 점차적으로 감소됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상들은 이들 이온들이 SK-PLG 복합체 가 작용하는 용혈 현상의 조절 기작에 관여 할 수 있다는 가능성을 제시해 준다.
이러한 일련의 실험결과로 부터 SK-PLG 복합체의 반응 기작을 제시할 수 있었으며 또한 이 결과들은 최근 여러 동물체 내에서 발견되고 있는 tissue plasminogen activator 연구에 많은 도움을 줄 수 있으리라 생각된다.
