Lignocellulosic raw materials are being extensively examined for the production of biofuel, biochemicals, and biopolymers. Xylose, which is one of the major components of hydrolyzed lignocelluloses, is a promising carbon source for microbial fermentation. In this study, recombinant R. eutropha NCIMB11599 expressing the E. coli xylA and xylB genes encoding xylose isomerase and xylulokinase respectively, named R. eutropha (pKM212-XylAB) was constructed and examined for the biosynthesis of poly(3-hydroxybutyric acid) (P(3HB)) from xy-lose. R. eutropha (pKM212-XylAB) was observed to utilize xylose as a sole carbon source. It accumulated 2.3 g/L of P(3HB) with a cellular P(3HB) content of 31.0 wt% form of 10 g/L of glucose and 10 g/L of xylose resulted in higher P(3HB) concentration and content of 5.7 g/L and 78.1 wt%, respectively. The P(3HB) concentration and con-tent further increased to 8.8 g/L and 88.7 wt% when a medium containing 15 g/L of glucose and 5 g/L of xylose was used. A hydrolysate solution of sunflower stalk as model lignocellulosic biomass was prepared and exam-ined for its application as feedstock in P(3HB) fermentation. The recombinant R. eutropha completely con-sumed glucose and xylose in the sunflower stalk-based medium to produce 7.8 g/L of P(3HB) with a P(3HB) content of 71.3 wt%.
본 연구에서는 sunflower stalks를 열수처리 과정을 통해 당화액을 얻었고 그 당화액에 포함되어 있는 6탄당인 glucose와 hemicellulose 주성분인 xylose를 혼합당으로 사용할 수 있도록 Ralstonia eutropha를 engineering과정을 통해 개발하여 Poly(3-hycroxybutyrate) (P(3HB))를 생산하는 공정에 대한 연구를 진행하였다.
해바라기의 씨앗은 39-49%의 기름을 함유하고 있으며 이 기름은 식용유로서 인간에게 이로운 기름으로 인식되었다. 해바라기 씨앗 기름의 수요가 증가함에 따라 부산물인 해바라기 줄기(sunflower stalks)도 함께 증가하여 환경문제가 발생하였다. 해바라기 줄기의 경우에는 pulp로 약간 이용된다. 그러나 대부분의 해바라기 줄기는 태워버리기 때문에 처리비용문제와 환경문제를 동시에 야기시켰다. 이러한 문제를 해결하고 해바라기 줄기를 보다 가치 있는 물질로 전환시키기 위해 본 연구가 진행되었다.
Lignocellulosic biomass를 mixed-sugar source로 이용하기 위한 연구는 많이 진행되고 있지만 인류의 식량문제와 겹치는 경향이 있어서 큰 성과를 보이지 못하고 있다. 해바라기 줄기는 식량문제와는 관련이 없는 lignocellulosic biomass로 아직 많은 연구가 진행되지 않았다. 해바라기 줄기는 건조시켰을 때의 100 g당 pentosane, holocellulose, alpha-cellulose, glucose, and xylose 로 구성되어 있다. 현재 1세대 바이오 매스로서 많은 연구가 되고 있는 사탕수수나 옥수수 찌꺼기와 비슷할 정도의 sugar함유양을 보았을 때 lignocellulosic biomass로서 가능성을 보여주었다.
해바라기 줄기를 lignocellulosic biomass로 이용하기 위해서는 전처리 과정이 필요하다. 열수처리 방식은 전처리 방법 중 한가지 이다. 이전까지 알려진 열수처리 방식은 lower temperature ($170-180^\circ C$)에서 lignocellulose에서 5탄당을 추출해내고 다음 단계로 higher temperature ($190-200^\circ C$)에서 효소의 활성을 향상시켜 cellulose에서 glu-cose로 변환을 최대로 한다. 그러나 본 연구에서 사용한 열수처리 방식은 (Jung et al., 2013)에서 언급하였듯이 lower temperature ($170-180^\circ C$)에서 one-step으로만 진행을 하여 sugar의 함량은 거의 차이가 없지만 공정의 효율을 증진시켰다. 해바라기 당화액을 이용해서 유용한 화학 제품을 생산하기 위해 선택한 미생물로 Ralstonia eutropha였다. R. eutropha는 Poly(3-hycroxybutyrate)를 생산 가능한 균주이고 monomer composition을 control해주면 다양한 polymer를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있다.
해바라기 당화액으로부터 P(3HB)를 생산하기 위해 우선 R. eutropha의 engineering과정이 필요했다. The wild-type R. eutropha NCIMB11599의 경우 glucose는 소모 가능하지만 xylose를 uptake 불가능하다. 그러므로 xylose uptake pathway 구축을 먼저 하였다. E. coli의 xylA(xylose isomerase)와 xylB(xylulokinase) 두 가지 gene을 plasmid 형태(pKM212-XylAB)로 만들어서 R. eutropha 에 넣어서 xylose를 소모 가능한지 확인하였다. Recombinant R. eutropha는 flask culture에서 96시간동안 xylose를 모두 소모하지 못하였지만 wild-type과는 비교가 될 정도로 소모한다는 것을 보여주었고 1 L batch culture로 배양시 약 120시간동안 xylose를 모두 소모 가능함을 확인하였다.
다음으로 당화액을 이용하기 위해서는 mixed sugar에서 R. eutropha를 배양이 가능한지 확인해야 하므로 controlled mixed sugar culture에서 배양을 진행하였다. Glucose 와 xylose의 비율이 1:1 혹은 3:1로 전체 sugar의 양은 20 g/L인 medium을 만들어서 배양하였다. Flask culture에서 wild-type cell은 xylose를 전혀 소모 못하였으나 xy-lose를 소모한 것을 보인 recombinant cell보다 P(3HB)생산량, 수율, 생산속도 모든 면에서 우세함을 보여주었다. 그러나 recombinant cell에는 transporter등 다른 engi-neering된 것이 없다는 점에서 생산량이 약간 차이 나는 것은 충분히 개선할 수 있는 요소로 보인다. Mixed sugar culture에서 recombinant R. eutropha가 xylose를 glucose와 함께 소모 가능한 것을 확인하였는데 여기서 R. eutropha의 특이한 점을 발견하였다. Yeast 혹은 E. coli의 경우 glucose와 함께 다른 sugar를 넣고 배양하게 되면 탄소 이화 작용 산물 억제(Carbon catabolite repression)(CCR) 때문에 이중영양적 생장(diauxic growth) 경향이 보이지만 이번 실험을 통해 R. eutropha NCIMB11599는 glu-cose와 xylose를 동시에 소모하는 것으로 보이고 xylose를 single sugar로 배양한 것보다 mixed sugar인 배양환경에서 소모속도가 더 빨라짐을 확인 할 수 있었다. 이는 glucose에 의해 다른 sugar를 소모하는데 억제작용이 미미하다고 생각 할 수 있다. 그러므로 여러 sugar가 섞여있는 당화액을 이용하는데 문제가 없을 것으로 보인다.
마지막으로 해바라기 당화액을 이용해서 발효를 진행해 보았다. Flask culture에서 re-combinant cell은 glucose, xylose, galactose, and mannose를 소모하는 경향을 보였으나 wild-type cell은 glucose, galactose, and mannose를 잘 소모하는 것을 보이나 xylose는 약간 소모하였다. Large scale culture에서 최고 P(3HB) productivity의 경우 recombi-nant cell은 0.19 g/L/h이고 wild-type cell은 0.15 g/L/h로 recombinant cell이 wild-type cell보다 더 높게 나왔다. 그러나 수율은 wild-type cell이 28.8 wt%이고 recombi-nant cell이 33.9 wt%로 productivity와 반대로 나왔다. Recombinant cell의 경우 P(3HB)의 생산량은 많지만 시간이 오래 걸리는 단점이 있다는 것을 알 수 있다. 본 연구에서 해바라기 당화액을 사용했지만 glucose와 xylose를 포함한 다당류 당화액이라면 recombinant R. eutropha를 이용해서 P(3HB)를 생산할 수 있다. 그리고 생산성, 수율, 생산속도를 향상시키기 위해 xylose transporter를 추가하거나 chromosomal DNA에 직접 xylAB gene을 넣는 방식 그리고 P(3HB) 합성경로 강화를 시도하고자 한다.
