서지주요정보
Development of auto-inducible gene expression system in corynebacterium glutamicum = 코리네박테리움 글루타미쿰 기반 자동 유도성 유전자 발현 시스템의 개발
서명 / 저자 Development of auto-inducible gene expression system in corynebacterium glutamicum = 코리네박테리움 글루타미쿰 기반 자동 유도성 유전자 발현 시스템의 개발 / Min Jeong Kim.
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2016].
Online Access 원문보기 원문인쇄

소장정보

등록번호

8029027

소장위치/청구기호

학술문화관(문화관) 보존서고

MCBE 16004

휴대폰 전송

도서상태

이용가능

대출가능

반납예정일

리뷰정보

초록정보

Corynebacterium glutamicum is a non-pathogenic, non-sporulating Gram-positive soil bacte-rium that is generally recognized as a safe organism (GRAS). Due to its safety and process perfor-mance, it has been used as a workhorse for industrial production of various proteins and biochemi-cals. As a result, many genetic manipulation tools have been developed to control the gene expres-sion systems and enhance the productivity. Among the various techniques, engineering of the pro-moter has been widely studied because it is effective in directly increasing the expression level of target genes. However, most promoters show some critical drawbacks in industrial-scale use. Consti-tutive promoters give continuous load to cells that can lower the growth rate. Also, inducible promot-ers involve inconvenient and expensive step of adding inducers. Therefore, the development of strong auto-inducible promoters is highly desired since they have great advantages in industrial-scale use by allowing auto-regulation without addition of the inducers. Here, an auto-inducible gene expression system was developed by engineering a sigma factor B (SigB)-dependent C. glutamicum native pro-moter of cg3141 gene. SigB was used as the auto-regulator to induce the gene expression during the transition between exponential growth phase and stationary phase. First, a synthetic promoter library was created by randomizing the critical promoter regions of cg3141 promoter with fixed -35 and -10 SigB binding sites. The auto-inducible promoters exhibiting high strengths and auto-inducibilities were isolated via FACS-based high-throughput screening. As a result, a strong auto-inducible pro-moter was isolated that exhibits a 3.5-fold inducibility and up to 20-fold higher strength compared to those of the original cg3141 promoter. Finally, the usability of the isolated promoter was verified with 5L lab-scale fed-batch cultivation of glutathione S-transferase (GST) as a target protein. Next, to im-prove the strength and inducibility of the auto-inducible promoters, the binding sequence of a re-pressor, ArnR, was added to the promoter region. A synthetic promoter library with fixed SigB and ArnR binding sites was created by randomization, and improved auto-inducible promoters were iso-lated via FACS sorting. As a result, stronger auto-inducible promoters with up to 70-fold higher strength were isolated. With ArnR over-expression, the auto-inducible promoters showed 4~6-fold inducibility. This is the first report on the development of an auto-inducible synthetic promoter in C. glutamicum, and this auto-inducible promoter will contribute to extend the usefulness of C. glutami-cum in the industrial-scale production of various recombinant proteins as well as value-added bio-chemicals.

코리네박테리움은 포자를 생산하지 않고 병원성이 없는 GRAS 그람 양성균으로, 높은 안전성과 생산성이 검증되어 현재 국내외 다수의 기업에서 아미노산, 항생제, 비타민 등의 생산에 이용되고 있는 산업적 유용 균주이다. 때문에 이 균주를 이용하여 더 많은 고부가가치 물질을 생산하기 위해 다양한 세포 엔지니어링 기술이 개발되고 있다. 코리네박테리움에서 고수율로 유전자를 발현하기 위해서는 유전자 발현 정도를 조절할 수 있는 유전자 발현 프로모터를 개발하는 기술이 중요하다. 프로모터는 단백질 발현이 시작되는 지점인데, 이는 미생물 내 단백질 생산량에 큰 영향을 주는 요소이기 때문에 강한 단백질 발현을 유도하는 프로모터 개발 기술은 코리네박테리움을 이용한 재조합 단백질의 생산 수율을 향상시킬 수 있어 저비용 고효율 생산 시스템에 유용하게 사용될 수 있다. 단백질 고효율 생산을 위해서는 세포 성장단계 중 초반부에는 목적 산물 발현이 억제되어 세포의 초기 성장 속도를 촉진시키고 세포가 원활하게 성장한 정상기에 유도인자의 투입을 통해 목적 산물의 생산을 유도하는 것이 효과적이다. 하지만 대부분의 유도인자는 독성을 띄거나 비싼 가격으로 인해 산업적 대량 생산 시스템에 사용하기에는 부적합하다는 단점이 있다. 이와 같은 기존 발현 시스템의 문제점을 해결하기 위해 세포 성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기의 코리네박테리움 내에서 자동으로 단백질 발현 시작을 돕는 시그마인자 B라는 전사 인자를 자동 유도인자로 사용한 자동 유도성 합성 프로모터를 개발하였다. 본 연구를 위해 먼저 코리네박테리움 균주 내에 기 존재하는 프로모터 중 시그마인자 B에 강한 활성을 보이는 프로모터를 선정하여 시그마인자 B에 대한 의존성을 평가하였다. 여러 프로모터 중 세포의 산화질소 해독 작용에 관여하는 cg3141 단백질을 발현하는 프로모터가 시그마인자 B에 대해 가장 강한 활성을 보여 cg3141 프로모터를 개량 대상으로 선정하였다. cg3141 프로모터 기반 자동 유도성 합성 프로모터를 제작하기 위해 cg3141 프로모터의 시그마인자 B의 결합 부위를 제외한 부분을 무작위 변이 시켜 통해 합성 프로모터 라이브러리를 구축하였고 형광 활성 세포 분류기를 통해 고효율의 자동 유도성 합성 프로모터를 분리하였다. 그 결과 정상기에서 지수 증식기 대비 3.5배 이상의 유도성을 가지고, 기존 cg3141 프로모터보다 20배 높은 활성을 가진 프로모터를 발굴하였다. 그 후 이 프로모터를 사용한 발효를 통해 코리네박테리움 내에서 재조합 단백질을 대량생산하였다. 이후 앞서 발굴된 프로모터보다 더 높은 활성과 유도성을 가진 프로모터를 개발하기 위해 지수증식기에 cg3141 프로모터의 활성을 억제하여 정상기 전 재조합 단백질 생산을 강력하게 억제할 수 있는 ArnR이라는 억제 유전자와 프로모터의 효과적인 결합을 유도시킬 수 있는 ArnR의 결합 부위를 도입한 라이브러리를 제작하였다. 형광 활성 세포 분류기를 통해 합성 프로모터를 분리하였고, 기존 cg3141 프로모터보다 70배 높은 활성을 가진 프로모터를 성공적으로 발굴하였다. 그리고, ArnR의 과발현을 통해 정상기에서 지수증식기 대비 4~6배의 높은 유도성을 가진 프로모터를 발굴하였다. 이 프로모터는 별도의 유도인자의 도입이 필요 없어 산업적 규모의 단백질 대량 생산 시스템에서 지속적인 세포 농도와 대사공학적 상태의 관측에 필요한 인력과 물자를 절약할 수 있고, 세포의 성장이 완료된 정상기에 단백질 발현이 유도되어 초기 세포의 대사공학적 부담을 덜어주어 단백질 고효율 생산에 유리하다. 산업적 재조합 단백질 생산에 주로 이용되는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 재조합 단백질이나 화학물질, 특히 세포 성장을 저해할 수 있는 독성 화학물질 또는 단백질의 대량 생산에 유리하게 사용될 수 있을 것이라 예측된다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {MCBE 16004
형태사항 vi, 54 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 김민정
지도교수의 영문표기 : Ki Jun Jeong
지도교수의 한글표기 : 정기준
학위논문 학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 References : p. 45-48
주제 Corynebacterium glutamicum
auto-inducible promoter
cg3141
sigma factor B
FACS sorting
코리네박테리움 글루타미쿰
자동 유도성 프로모터
cg3141
시그마인자 B
형광 활성 세포 분류기
QR CODE qr code