Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has been widely used for the analysis of nucleic acids, peptides, and proteins with precise and rapid measurement of their mass. MALDI-TOF MS was provided the capability of measuring both low and high molecular mass compound and the benefit to analyze com-plex mixtures. The purpose of this study is development of the diagnosis of genitourinary in-fections and antibiotic resistance marker for the medical treatment of sexually transmitted diseases (STD) by nucleic acid fragment utilizing MALDI-TOF with simplicity and rapidity.
In this study, we developed detection method of genitourinary infections by nucleic ac-id fragment using nicking endonuclease. We designed PCR primers containing restriction site to promote activity of nicking endonuclease and mass marker to distinguish various genitouri-nary pathogen at the end of 5’. In the only presence of genitourinary pathogen, amplification of pathogen gene was accomplished resulting that restriction recognition site to accelerate nicking enzyme was incorporated to amplicon. Since nicking endonuclease has a role as cleavage of double-stranded PCR amplicon from genitourinary pathogen, diverse nucleic acid fragments which stand for genitourinary pathogen were generated after amplification of pathogen gene and endonuclease reaction. Following isolation of mass fragment from reac-tion solution, we could diagnose infection through MALDI-TOF measurement.
Since STD frequently strike by multiple infections of genitourinary pathogens, it is of importance multiple diagnose of 14 pathogens simultaneously above all. In this study, we have been also performed multiple detection of genitourinary infections. 14 genitourinary pathogens were divided into 3 groups, and we performed multiplex PCR with 3 tubes. As a result, we could detect all selected pathogens.
비뇨생식기 감염성 질환은 전 세계적으로 빈번하게 일어나는 세균 감염성 질환이다. 대부분의 비뇨생식기 감염성 질환은 감염 시 징후가 나타나지 않는 경우가 많아서 효과적인 치료를 위하여 정교한 초기 진단이 매우 중요하다. 전통적인 검사 방법인 세포 배양 검사는 고도의 숙련도를 요구하고 시간이 많이 걸리기 때문에 신속하고 빠른 질병 진단으로는 적합하지 않다. 따라서 많은 연구자들은 신속한 진단과 치료를 위한 연구에 집중하고 있다. 기존의 연구들은 multiplex PCR (polymerase chain reaction) 을 이용한 형광 분석 방법에 기반한다. 하지만 형광 분석 방법은 민감도가 낮고 검사 소요시간이 길고 고가의 시료를 사용한다는 단점을 가지고 있다. 따라서 본 연구에서는 MALDI-TOF 질량 분석 기술을 적용하여 이와 같은 문제점을 극복하고자 한다. 기존의 질량 분석 기기는 제한된 조건에서만 시료를 측정할 수 있어서 단백질이나 핵산, 펩타이드와 같은 생체 분자들을 측정하기에는 많은 어려움이 있다. 하지만 MALDI-TOF 질량분석기는 생체 물질의 변형 없이 질량을 측정할 수 있는 장점을 가지고 있다.
본 연구의 진행 방향은 다음과 같다. 먼저 감염이 추정되는 환자에게서 채취한 샘플에서 DNA 를 추출하고 그 DNA 를 PCR 과정을 통해서 증폭한다. PCR에 적용된 primer 에는 짧은 염기 서열로 이루어진 mass marker 의 상보적인 염기 서열과 역시 특정 염기 서열로 이루어진 절단 효소 인식 부위 (nicking enzyme recognition site) 가 포함되어 있다. mass marker 는 MALDI-TOF 질량분석기에서 쉽게 질량을 측정할 수 있는 각 질병을 대표하는 역할을 담당하고 절단 효소 인식 부위는 증폭된 DNA 에서 mass marker 만 잘라낼 수 있는 절단 효소 (nicking enzyme)가 반응할 수 있도록 해 준다. PCR 후 생성된 amplicon 에 nicking enzyme 을 반응시키면 짧은 길이의 mass marker DNA 가 생성되고 정제 과정을 거쳐서 MALDI-TOF 질량분석기로 분석하면 특정 표적 감염균의 mass marker 의 mass peak 의 유무를 확인함으로써 감염성 질환의 유발 원인균의 존재 여부를 알 수 있다. 본 연구에서는 14 종의 비뇨생식기 감염성 질환 원인균의 DNA 를 선정하여 이들의 존재 여부를 확인할 수 있었다. 또한, 분석 과정을 최적화함으로써 검출 과정에 소요되는 시간을 단축할 수 있었다. 이 기술은 primer의 설계에 따라 본 연구의 표적 대상인 14종의 원인균뿐만 아니라 다양한 감염성 질환의 감염 여부를 확인할 수 있다. 따라서 본 연구는 정확도, 신속함 등의 장점뿐만 아니라 여러 감염성 질환의 진단에도 적용 가능한 확장성도 가지고 있어 앞으로 질병 진단에 있어서 다양하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다
