Nature finds ways of protecting cellular components and preserving genetic information against external stresses such as nutrient deprivation, desiccation, high temperatures, radiation, and caustic chemicals. For example, bacteria and fungi are covered with a cell wall or robust membrane composed of polysaccharides or peptidoglycans. Certain unicellular organisms, such as diatoms, foraminifera, coccoliths, and rhabdoliths, are encased within exoskeletal shells made of silica or calcium carbonate. However, most mammalian cells do not have a robust membrane or exoskeleton. Instead, they are enclosed in a lipid bilayer, which is fluidic and vulnerable to changes in its environments. Because the surfaces of mammalian cells are not protected or reinforced by a tough coat, it is more difficult to treat mammalian cells in vitro than microbial cells. In this thesis, we report a cytoprotective degradable nanocoat for mammalian cells. Three types of mammalian cells (HeLa cells, NIH 3T3 fibroblasts, and Jurkat cells) were individually coated within metal polyphenol and silica shells, inspired by biomimetic silicification. To maintain the viability of the mammalian cells, we performed the whole processes under strictly physiological culture conditions, and carefully selected nontoxic materials, established with toxicity tests.
Bioinspired silicification has attracted a great deal of attention as a cytocompatible method for encapsulating proteins and living cells, because it does not require harsh conditions that harm proteins or cells. Although bioinspired silicification has successfully been used to encapsulate individual microbial cells, which have durable cell walls, the conditions required to coat mammalian cells with silica are yet to be optimized because mammalian cells are inherently fragile. We systematically varied the silicification conditions and optimized them to coat HeLa cells, the model cells, with silica. We found that the use of Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) greatly increased cell viability during silicification, and also optimized the reagent concentrations and reaction time for coating individual HeLa cells with cytocompatible silica. The HeLa cells, in suspension, were then individually coated with silica, in a cytocompatible way with bioinspired silicification. The silica coating greatly enhanced the resistance of the HeLa cells to enzymatic attack by trypsin and the toxic compound poly-(allylamine hydrochloride), and suppressed cell division in a controlled fashion. This bioinspired cytocompatible strategy for coating single cells was also applied to NIH 3T3 fibroblasts and Jurkat cells. Individual HeLa cells were also coated with titania $(TiO_2)$ using a specifically designed peptide that was both cytocompatible and catalytic for the formation of $TiO_2$. After the cytocompatibility of the catalytic templates was established, HeLa cells were encapsulated by immersing them alternately in solutions of $(RKK)_4D_8$ and titanium bis(ammonium lactato)dihydroxide. The viability of the coated HeLa cells was maintained and the cells showed greatly enhanced resistance to ultraviolet C (UV-C) radiation.
Tannic acid (TA), a type of polyphenol containing 1,2,3-trihydroxybenzoic acid (gallic acid), can chelate $Fe^{III}$ in seconds (~10 s) under biocompatible conditions (aqueous solution, neutral pH), generating a high-ly stable metal organic nanofilm. The nanofilm formed of TA and $Fe^{III}$ (TA- $Fe^{III}$) is structurally rigid and degradable by external stimuli under mild conditions, and can therefore be used to cytocompatibly nanocoat mammalian cells. Taking advantage of the process that forms the TA-$Fe^{III}$ complex, three types of mammalian cells (HeLa, NIH 3T3, and Jurkat T cells) were coated with TA-$Fe^{III}$. Briefly, a suspension of cells was prepared in serum-free DMEM (pH 7.4) as the reaction medium. Solutions of $FeCl_3$ (0.1 mg/mL^{-1})$ and TA $(0.4 mg/mL^{-1})$ were added sequentially to the cells and incubated for 10 s. The TA-$Fe^{III}$ nanocoat effectively protected the coated mammalian cells against UV-C radiation and a toxic compound. More importantly, cell proliferation was controlled by the programmed formation and degradation of the TA-$Fe^{III}$ nanocoat, mimicking the sporulation and germination processes found in nature.
The chemical control of cell division has attracted much attention in the fields of single-cell-based biology, high-throughput screening platforms, and clinical applications. For example, the loss of growth control is a characteristic of many disease states, including cancer. A mussel-inspired cytocompatible encapsulation method to control cell division with cross-linked layer-by-layer (LbL) shells is developed. Catechol-grafted polyethyleneimine and hyaluronic acid were chosen as the polyelectrolytes for the LbL process, and were cross-linked at pH 8.5. Cell division was controlled by the number of LbL nanolayers and the cross-linking reaction. Cells replicate and segregate their genetic material in specific phases of the cell cycle. Because the growth of the coated cells was retarded, we investigated the changes in the cell cycles of the TA-$Fe^{III}$ -coated HeLa cells. Before the HeLa cells were coated with TA-$Fe^{III}$, we synchronized the cell cycle of the cells to M/G1 or G1//S using the double thymidine block method, and the state of the cell cycle was confirmed with Fucci cell-cycle staining and propidium iodide.
자연에 존재하는 박테리아 내생포자(endospore) 는 온도, 습도, 또는 영양분의 고갈에 의해 자신의 생존이 부적합하다고 판단되면 자신을 보존하기 위하여 생식력이 없는 휴면기 상태인 내생포자로 바뀐다. 형성된 내생포자는 그 종류와 환경에 따라서 장기간 생존할 수 있으며 이는 내생포자가 외부적으로는 열, 자외선, 건조환 환경 등에 저항성이 있고 내부적으로는 신진 대사를 극한으로 낮춰 영양분을 필요치 않게 하기 때문이다. 또한, 포자는 주위의 환경이 번식하기에 적합하다고 인식하면 스스로 그 껍질을 없애고 분열, 증식하는 모습을 보인다. 즉 포자의 형성은 세포가 자기 자신을 보호하고 유전정보를 다음세대에 넘기기 위한 하나의 생존 수단이라고 할 수 있다. 그러나 자연에 존재하는 대부분의 세포는 내생포자를 형성할 수 없기 때문에 인공적으로 세포에 화학반응을 통해 포자, 인공껍질을 만들어주는 연구가 필요하다.
세포에 인공적으로 껍질을 형성하게 되면 크게 3가지의 효과를 기대할 수 있다. 1) 세포에 외부환경에 대한 저항성 부여, 2) 세포의 분열과 증식을 조절, 그리고 3) 껍질에 특정 원소나 분자를 넣어 기능화 하는 것이다. 세포를 기반으로 진행되는 실험에서 세포를 보호하는 인공껍질을 적용할시 원하지 않는 세포사멸을 막아줄 수 있으며, 실험이 진행되는 동안 세포의 증식을 막아 변수를 줄일 수도 있다. 또한 세포가 가지고 있지 않은 기능을 껍질에 탑재시킬 수 있다. 구체적인 예로, 최근 활발하게 연구되고 있는 자가면역세포에 이 기술을 적용할 수 있을 것이라 예상 된다. 이것은 자신이 건강한 상태일 때 자신의 면역세포를 배양, 증식 시킨 뒤 보관하고 면역력이 약해졌을 때 자신의 몸에 투입시켜 면역력을 극대화 시키는 기술인데, 증식된 세포를 운반, 보관하는 과정에서의 세포의 피포화가 세포의 안정성을 증가하는데 기여할 수 있을 것이라 보인다. 따라서 본 연구에서는 동물세포를 생체친화적인 화학반응과 물질로 피포화해 포자화 했으며 피포화된 세포는 앞서 언급한 보호, 분열제어, 껍질 기능화의 성질을 가지게 되었다.
앞선 포자화의 연구들이 모두 미생물을 기반으로 진행되었기 때문에 동물세포에 친화력을 가진 피포화 방법을 찾는 것이 우선시 되어야 했다. 동물세포의 경우 세포벽이 존재하지 않고 미생물보다 주위환경에 더 민감하기 때문에 지금까지 세포를 피포화하거나 코팅하는 것에 어려움이 있었다. 따라서 동물세포 생존에 적합한 물질과 반응을 찾는 것이 우선시 되었으며 생체친화적인 환경에서 사용할 수 있는 생광물화 반응(biomineralization), 그리고 타닌산(TA)과 철 이온(Fe(III))간의 결합을 이용한 TA-Fe(III) 필름으로 피포화를 시도하였다.
피포화한 동물 세포는 양이온 고분자, 효소, 자외선과 같은 외부유해인자에 대해 큰 저항성을 보였으며 세포 분열이 억제되고 증식하지 않는 인공포자의 기능을 완벽하게 수행해 내었다. 또한 생광물화 반응을 통해 세포에 거의 존재하지 않는 티올기(-SH)를 껍질에 도입, 선택적인 반응을 통해 껍질에 원하는 물질을 화학적으로 결합할 수 있었다. 즉, 동물세포에 인공적인 껍질을 성공적으로 형성시켰고 피포화된 세포는 인공포자의 주요 기능인 세포분열제어, 외부자극에 대한 보호, 기능화 할 수 있는 것을 보여주었다.
