The development of lymphatic vessels (LVs) and lymph nodes (LNs) occurs in a coordinated fashion during embryogenesis. Although the LN ontogeny is well known, its current morphology has been established mainly based on section immunohistological approaches limiting further spatiotemporal pattern analysis in three dimensions which needs to be elucidated. Here, I demonstrate additional structural perspectives of LVs during LN anlagen development by analyzing Prox1-GFP and $Vegfc^{+/LacZ}$ mouse models through whole mount immunohistochemical protocol. Prox1+ lymphatic endothelial cells (LECs) formed string-like connections rather than the lymph sac-like structures until E14.5 and the LEC coverage around the anlagen was complete before birth. $Vegfc^{+/LacZ}$ mice exhibited markedly smaller LNs in neonates and adults, presumably due to a decrease in LTi cell clusters and migrating $Prox1^+$ LECs during embryogenesis, indicating that the VEGF-C/VEGFR3 signaling plays an important role in normal LN formation through proper migration and organization of the LECs in the embryos. In addition, Vegfc- haploinsufficiency or inhibition of VEGFR3 signaling resulted in an impairment in LN LV ingrowth at postnatal day 3, leading to a significant decrease in LN volumes. During acute inflammation, $Vegfc^{+/LacZ}$ mice exhibited decreased LN LV expansion as well as smaller LNs. Taken together, my findings provide useful anatomical information to current model of mouse LN formation in relation to the LVs, and compelling evidences supporting that LV contribution through VEGF-C/VEGFR3 signaling is critical in LN development and maturation.
림프관 (lymphatic vessels)은 심혈관계와 함께 고등 척추동물내의 순환기계통을 이루는 매우 필수적인 2차적 혈관계이다. 배아 발달 과정에서 신생 림프관 형성 (Lymphangiogenesis) 과정에 의해 형성된 초기 림프낭 (lymph sac)은 지주정맥으로부터 비롯되어 몸 전체로 복잡하고 기능적인 림프관구조를 이루게 된다. 이 림프관들은 기관들 사이에서 조직내의 체액 항상성, 지질 흡수, 면역 세포 이동 및 감시, 그리고 염증완화 등의 다양한 역할을 수행한다. 특히 빠르고 적절한 면역반응을 위해서는 제대로 형성된 림프관과 림프절 (lymph node)이 중요한데, 흥미롭게도 이 두 기관들은 이른 배아 발달 과정 시기부터 필수적인 분화 신호들을 공유하면서 시공적으로 동시화적인 발달과정을 거친다. 그럼에도 불구하고 림프절 발달과 성숙 과정에 있어 림프관의 중요성에 대해서는 명확하게 밝혀지지 않았다. 이 논문은 생쥐 서혜부 림프절 (inguinal lymph node)을 이용하여 배아시기와 출생 후의 림프절과 주변 림프관의 발달 패턴, 림프절내 림프관 형성 시기 및 발달 패턴, 그리고 림프절 림프관 발달 과정에서 VEGF-C/VEGFR3 시스템의 역할에 대해 밝힘으로써, 림프관과 VEGF-C/VEGFR3 시스템이 림프절 발달과 성숙 과정에서 수행하는 중요성을 조사하였다.
대부분의 림프절 발달 연구는 direct microdissection이나 whole mount embryo section과 같은 일반적인 조직 절편을 이용한 면역조직화학염색법을 통하여 초기 발달 과정에서 림프절의 미세조직을 예상하고 그것을 구성하는 세포들의 특색을 밝혀내었다. 그러나 이러한 방식은 조직 샘플 준비과정에서 조직 훼손과 손실을 유발할 가능성이 높고 또한 조직 주변환경과, 조직 자체를 구성하는 주요 세포들의 배열 같은 3차원적 형태학적인 정보를 얻기에는 한계가 있기 때문에 본 연구자는 Prox1-GFP 유전자 변형 생쥐 모델을 이용하여 whole mount 면역형광염색으로 배아시기 림프절과 림프관 발달 패턴을 시각화하였다. 지금까지 알려진 E13 시기의 림프낭으로 이루어진 bud 모양의 초기 림프절 원기와는 다르게 E12.5-14.5시기의 림프절 원기는 림프낭이 아닌 string-like 패턴을 이루는 Prox1+림프관 내피 세포들 (LECs)의 연결들로 둘러 쌓여가기 시작하였고 E18.5 시기 이후가 되어서야 비로소 완전한 coverage가 이루어짐을 처음으로 밝혀내었다. 또한 E12.5와 E14.5 사이에 LEC의 핵 모양이 방추형이거나 다른 불규칙적인 모양에서 동그랗고 규칙적인 모양으로 바뀌었는데 혈관을 따라 이동해온 LEC들이 더 체계적으로 발달할수록 migratory 성향을 잃어가는 모습이 관찰되었다.
배아시기 림프절 주변 림프관 신생과정에서 림프관의 역할을 규명하고 Prox1-/-와 같은 유전자 변형 생쥐 모델의 embryonic lethality 같은 실험적 한계를 극복하기 위해 Vegfc+/LacZ 모델을 이용하여 Vegfc 반수체기능부전으로 인한 영향을 관찰하였다. E12.5와 E14.5 시기에 초기 림프절 원기 발달 주변으로 이동한 Prox1+LEC의 수가 줄어들었고, 림프절 원기 초기 발달 과정 중 제일 중요한 LTi cell recruitment 역시 감소하였다. 흥미롭게도 이러한 현상은 출생 후, 그리고 성인시기의 림프절 크기와 모양에도 영향을 주었다. 림프절 원기 초기 발달과정에서 림프낭이 필수적 요소가 아님에도 불구하고 이후 온전한 림프절의 발달과 성숙을 위해서는 초창기 배아시기에서 Prox1+LEC의 적절한 migration과 조직 형성이 중요하다는 것을 확인하였다. 이로써 LEC가 림프절 형성에서 구조적으로 중요한 동시에 LTi cell recruitment에 필요한 attraction chemokine을 생성하는 추가적인 출처로서 림프절 초기 발달과정에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 뒷받침 할 수 있었다.
출생 후 림프절을 whole mount 면역형광염색법으로 시각화 해 본 결과, P0부터 주변 유입림프관 (afferent LVs)이 잘 형성되어 있었다. 림프절 내의 림프관 형성 시기는 아직까지 잘 알려지지 않았기에 본 연구자는 림프관 특이적 마커인 LYVE-1과 Prox1, 혈관 특이적 마커인 PECAM-1을 이용한 조직 절편 면역형광염색을 통해 림프절내 림프관을 시각화하였다. 그 결과, P1-P2 시기 림프절은 림프절 내 림프관 형성이 보이지 않았으나 림프절 혈관 입구 근처에 Prox1-Lyve-1+세포들이 많이 분포되어있음을 확인하였고, Vegfc+/LacZ 모델을 이용하여 β-galactosidase activity를 확인 한 결과 VEGF-C+세포들의 분포 역시 확인하였다. P3 시기의 림프절에서 Lyve-1+Prox1+PECAM-1+림프관 발아를 발견하였다. 림프절 내 림프관 형성 과정에서 VEGFC/VEGFR3의 역할을 확인하고자 Soluble VEGFR3 단백질을 처리한 후 P3 림프절을 관찰한 결과, 림프절의 크기가 감소하고, 림프절 내 림프관 형성이 억제되었으며, 림프관 sprouting이 확연하게 감소하였다. 본 실험 결과를 통해 림프절 내 림프관은 출생 사흘 후 정도에 형성되기 시작하며 VEGF-C/VEGFR3 시스템이 출생 후 림프절 림프관 신생과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
염증반응이 일어나는 과정에서 Vegfc 반수체기능부전이 림프절 내 림프관에 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해 Vegfc+/LacZ 생쥐의 귀 피부 조직에 Lipopolysaccharide (LPS)를 주입하여 draining 림프절의 림프관을 관찰하였다. 정상 생쥐에서는 림프절의 크기가 매우 증가하고 림프절 내 림프관 리모델링을 통해 림프관 expansion이 활발하게 이루어졌으나 그에 비해 유전자 변형 생쥐에서는 림프관 expansion이 적게 발생되었음을 관찰하였다.
종합적으로 본 연구는 whole mount 면역염색기법을 통하여 초기 림프절 원기 발달 과정 중, 림프절과 주변 림프관 발달 과정에서 bud형태가 아닌 LEC들의 연결로 이루어진 새로운 구조 형태학적 측면을 발견하였고 이 LEC들의 적절한 migration과 organization은 이후 LTi cell recruitment를 위한 attraction chemokine 생성과 림프절 구조 발달에 큰 기여를 한다는 것을 확인하였다. 림프절 내 림프관 형성은 출생 후 VEGF-C/VEGFR3 신호전달체계를 통해 이루어지고 이 체계에 결함이 생길 시 염증과 같은 병리학적 상황에서 림프절 내 림프관 리모델링이 정상적으로 이루어지지 않음을 확인하였다. 따라서 정상적인 림프절 발달과 성숙과정을 위해서는 VEGF-C/VEGFR3 시스템을 통한 림프관 발달이 매우 중요한 역할을 한다는 것을 규명하였다.
