Part I. Brain somatic mutations of MTOR cause focal cortical dysplasia type II leading to intractable focal epilepsy in human and mouse.
Focal cortical dysplasia type II (FCDII) is a developmental malformation of cerebral cortex and an important cause of medically refractory epilepsy. FCDII sporadically occurs, and this condition is characterized by dysmorphic neurons and disrupted cortical lamination in affected cortical regions. It has been hypothesized that FCD is caused by somatic mutations in affected regions. However, no such mutations have been identified. Here, I report de no-vo somatic mutations of MTOR in the affected brains of FCDII patients. Deep whole exome sequencing (read depth, 412-668×) validated with the use of site-specific amplicon se-quencing (read depth, 100-347,499×) in paired brain-blood DNA from 4 FCDII patients revealed a brain somatic mutation, MTOR c.7280T>C (p.Leu2427Pro) in 2 patients. I then performed deep sequencing of MTOR gene in additional 73 FCDII patients using two dif-ferent sequencing platforms such as hybrid capture (read depth, 100-17,700×) and PCR amplicon sequencing (read depth, 100-20,210×). In total, I identified 9 different somatic missense mutations of MTOR in 12 FCDII patients, which were reproducibly reported in both sequencing platforms and in multi-samples from the brain tissue block of each patient. Identified mutations accounted for 15.6% of all FCDII participants (12 of 77). The preva-lence of the mutant allele in affected brain tissues ranged from 1.26% to 12.6%. The identi-fied mutations induced the constitutive activation of mTOR kinase and cytomegalic neu-rons in affected brains carrying these mutations. In addition, the focal cortical expression of MTOR mutant in in utero electroporated mice was sufficient to interfere with proper neu-ronal migration and cause spontaneous seizures with epileptic discharge and cytomegalic neurons. Furthermore, rapamycin, an inhibitor of mTOR, suppressed cytomegalic neurons and epileptic seizures. Therefore, this study provides the first evidence that brain somatic activating mutations in MTOR cause FCD as well as the potential drug target for intractable epilepsy in FCD patients.
Keywords: focal cortical dysplasia, somatic mutation, mechanistic target of rapamycin (MTOR)
Part II. Brain somatic mutations in TSC1 and TSC2 lead to FCDII patients negative for mTOR mutations and in utero somatic genome editing with CRISPR/Cas9 system recapitulates TSC1 and TSC2 mutations in mouse models.
Together with my finding in Part I, it was recently reported that the brain somatic mutations in MTOR accounted for 15-25% of FCD type II (FCDII) characterized by cortical dyslami-nation and dysmorphic neurons. However, molecular genetic etiologies of remaining FCDII patients negative for MTOR mutation remain unclear. Here, I performed deep hybrid-capture and amplicon sequencing (100 - 20012X, read depth) of five important mTOR pathway genes including PIK3CA, PIK3R2, AKT3, TSC1, and TSC2 in paired brain-blood (or saliva) tissues from 47 FCDII patients negative for MTOR mutations. I found that 5 out of 47 patients (10.2%) have brain somatic mutations in TSC1 and TSC2 genes such as TSC1 c.64C>T (p.Arg22Trp), TSC1 c.610C>T (p.Arg204Cys), and TSC2 c.4639C>T (p.Val1547Ile) reproducibly reported in two different sequencing platforms. Especially, TSC1 c.64C>T (p.Arg22Trp) was recurrently found in 3 patients. Their mutational burdens ranged 1.0 to 2.8% in affected brains. All identified mutations induced the hyperactivation of mTOR pathway by disrupting the formation or function of TSC1/TSC2 complex. Fur-thermore, to recapitulate low-level somatic alterations in TSC1 or TSC2 in vivo, I estab-lished the one-step generation of brain somatic alterations in mouse using in utero electro-poration of CRISPR/Cas9 system (in utero CRISPR/Cas9 system). In utero CRISPR/Cas9 system mediated disruptions of TSC1 or TSC2 gene in focal cortical regions were sufficient to induce all pathological and symptomatic FCDII phenotypes, such as severe spontaneous seizures, cytomegalic neurons, and cortical dyslamination. This study shows that that brain somatic mutation in TSC1 and TSC2 cause FCDII and in utero CRISPR/Cas9 system is use-ful for generating faithful animal models of neurodevelopmental disorders with brain so-matic mutations.
Keywords: mTOR pathway, tuberous sclerosis complex, CRISPR/Cas9 system, mouse model
Part I. Brain somatic mutations of MTOR cause focal cortical dysplasia type II leading to intractable focal epilepsy in human and mouse.
2형 국소피질이형성증(이하 FCDII) 은 대뇌 피질의 발달기형에 속하는 질환으로 난치성 간질의 중요한 원인 중 하나이다. FCDII은 대뇌에서 산발적으로 발생하며 이형 (dysmorphic) 신경세포를 보이고 영향을 받은 부위의 층구조 (lamination) 파괴를 동반한다. 선행 연구를 통해 국소대뇌피질이형성증이 체성유전변이에 의해 발생할 것이라는 추측이 있었지만 현재까지 그러한 유전변이는 발견되지 않았다. 이에 본 연구를 통해서 FCDII환자의 MTOR유전자에서 de novo 체성유전변이를 발견하였으며 이를 보고하고자 한다. FCDII 환자 4명의 혈액-대뇌 시료를 모두 확보하여 deep whole exome sequencing (read depth 412-668x)을 시행하였고 이를 site-specific amplicon se-quencing (read depth, 100-347499x)으로 재확인한 결과, 2명의 환자에서 MTOR c.7280T>C(p.Leu2427Pro) 유전변이를 발견하였다. 이후 추가적으로 FCDII 환자 73명에 대해 MTOR유전자를 타겟으로 hybrid capture sequencing (read depth 100-17700x)와PCR amplicon sequencing (read depth, 100-20210x)을 시행하였다. 그 결과, 12명의 환자에서 9개의 서로 다른 유전변이를 발견하였으며 이는 2가지 platform (hybrid capture, amplicon sequencing)에서 모두 공통적으로 확인되었다. 최종적으로 전체FCDII 환자군77명 중 12 명에서 유전변이를 발견하였으며 이는 비율상15.6%에 해당한다. 질환 대뇌조직에 존재하는 유전변이율은 1.26%에서 12.6%였다. 발견한 유전변이들은 mTOR kinase의 구조적인 활성을 유도하였으며 유전변이를 가진 환자의 대뇌조직에서 거대신경세포가 관찰되었다. 전기천공법 (in utero electroporation)을 이용하여 MTOR 유전변이를 발현시킨 쥐에서 신경세포이동 (migration)이 감소하였고 간질파를 동반한 자발적 발작과 거대신경세포를 보였다. 또한 이 쥐에게 mTOR 억제제인 라파마이신을 투여했을 때 거대신경세포 크기와 간질발작횟수가 감소하였다. 이 연구를 통해 MTOR유전자의 체성활성유전변이가 FCDII를 야기한다는 사실을 밝혔으며 이를 통해 FCD 환자의 잠재적인 약물치료 가능성을 열었다.
핵심어 : 국소 대뇌 피질 이형성증, 체성 유전변이, mechanistic target of rapamycin (MTOR)
Part II. Brain somatic mutations in TSC1 and TSC2 lead to FCDII patients negative for mTOR mutations and in utero somatic genome editing with CRISPR/Cas9 system recapitulates TSC1 and TSC2 mutations in mouse models.
선행 연구를 통해 2형 국소피질이형성증(이하 FCDII) 환자의 15~25% 정도가 MTOR 유전자의 대뇌 특이적 체성 유전변이에 의해 유발된다는 것이 밝혀졌다. 그러나 MTOR 유전자에 유전변이를 가지지 않은 FCDII 환자의 경우 여전히 그 원인을 모르는 실정이다. 따라서 이를 밝히기 위해 우리는 PIK3CA, PIK3R2, AKT3, TSC1, TSC2 를 포함하는 mTOR pathway 유전자 시퀀싱 패널을 제작하여 MTOR 유전변이를 가지지 않은 47명의 환자에 대해 hybrid capture sequencing 과 amplicon sequencing (100-20012X, read depth)을 시행하였다. 모든 sequencing은 FCDII로 확진된 뇌조직과 그에 상응하는 정상조직(혈액, 타액)에서 genomic DNA를 추출하여 시행하였다. 그 결과, 47명의 환자 중 5명의 환자에서TSC1 c.64C>T (p.Arg22Trp), TSC1 c.610C>T (p.Arg204Cys), and TSC2 c.4639C>T (p.Val1547Ile) 체성 유전변이를 발견하였으며 이는 2가지 se-quencing platform에서 모두 확인되었다. 이중TSC1 c.64C>T (p.Arg22Trp) 유전변이의 경우 3명의 환자에서 반복적으로 확인되었으며 3가지 유전변이의 allele frequency는 1.0 ~ 2.8% 의 범위를 가지고 있었다. 발견한 3가지 유전변이 모두 세포 수준에서 mTOR pathway를 활성화 시키는 것을 확인되었으며 이는 유전변이가 TSC1/TSC2 complex의 형성을 방해하거나 TSC2에 위치하는 GAP (GTpase activating protein) 활성을 감소시키기 때문인 것으로 확인되었다. 발견한 저빈도의 대뇌 특이적 체성 유전변이를 반영하는 동물 모델을 제작하기 위하여 CRISPR/Cas9 system을 이용한 in utero electroporation 을 시행하였다. 이를 통해서 TSC1 또는 TSC2의 체성 유전변이가 동물 수준에서 자발적인 발작, 거대신경세포 (cytomegalic neuron), 신경세포이동감소와 같이 환자에게서 발생하는 병리적, 임상적 증상을 유발할 수 있음을 확인하였다. 이 연구를 통해서 TSC1 또는 TSC2 유전자의 체성유전변이가 FCDII를 야기할 수 있다는 사실을 밝혔으며 CRISPR/Cas9 system이 대뇌 체성 유전변이를 보이는 뇌신경 발달장애의 동물 모델 제작에 유용한 도구임을 확인하였다.
핵심어 : mTOR 신호전달계, 결절 경화 복합체, CRISPR/Cas9 system, 마우스 모델
