Hepatitis C virus (HCV) is a positive-stranded RNA virus of the genus Hepacivirus in the family Flaviviridae that infects approximately 170 million people worldwide. Acute HCV infection is spontaneously cleared in 20 to 30% of patients; however, the majority of patients fail to clear HCV and develop chronic persistent infection, which tends to progress to life-threatening liver diseases such as liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In 2005, the first HCV infection system in cell culture was established using clone Japanese Fulminant Hepatitis-1 (JFH-1), and the development of cell culture-derived HCV (HCVcc) systems has allowed us to understand how hosts respond to HCV infection and how HCV evades the host responses.
Although the mechanisms underlying the different outcomes of HCV infection are not fully understood, innate immune responses seem to have a critical impact on the outcome of HCV infection, as demonstrated by the prognostic value of interferon (IFN)-λ gene polymorphisms among patients with chronic HCV infection.
After HCV infection, innate sensing of the virus in infected hepatocytes occurs through the pattern recognition receptors, leading to downstream signaling that results in the induction of type III and I IFNs. These secreted IFNs have been demonstrated as inducers of antiviral interferon-stimulated genes (ISGs) in HCV-infected cells. Upregulation of these ISGs is sustained in HCV-infected livers. However, paradoxically, HCV-infected patients with high levels of ISGs in their liver at baseline respond poorly to pegylated $IFN- \alpha-based$ treatment. Previous reports have identified ubiquitin specific peptidase 18 (USP18) as a critical factor conferring unresponsiveness to exogenous IFN-α treatment by blocking the generation of phosphorylated signal transducer and activator of transcription (STAT) proteins, although the mechanism underlying the maintenance of increased level of USP18 protein in HCV-infected liver was not clearly elucidated.
In this dissertation, I investigated and clarified the mechanism of prolonged ISG expression and its role in IFN responsiveness during HCV infection in relation to unphosphorylated interferon-stimulated gene factor 3 (U-ISGF3), recently identified as a tripartite transcription factor formed by high levels of interferon-regulatory factor 9 (IRF9), STAT1, and STAT2 without tyrosine phosphorylation of the STATs.
First, I established high-titer HCVcc infection system and HCVcc-permissive, immune-competent cell culture model. I confirmed the robust production of IFN-λs and IFN-β in primary human hepatocytes and cell lines after high-titer HCVcc infection.
Second, I found that the protein level of USP18 is increased in HCV-infected liver and IFN-λ-treated hepatoma cells, blocking the phosphorylation of STAT1 in response to exogenous IFN-α. Recently, intracellular free interferon-stimulated gene 15 (ISG15) was reported to regulate the stability of USP18 protein. I checked the level of ISG15 in HCV-infected liver and IFN-λ-treated hepatoma cells, and it was upregulated at both mRNA and protein levels. Silencing ISG15 decreased the protein level of USP18 in these cells and restored the USP18-mediated attenuation of STAT1 phosphorylation after treatment with IFN-α. Moreover, forced expression of IFNL4 also conferred unresponsiveness to IFN-α via ISG15/USP18 axis. Therefore, I concluded that ISG15 sustains the abundance of USP18, resulting in defective STAT1 phosphorylation in response to exogenous IFN-α in HCV-infected liver.
Next, I noticed that the level of U-ISGF3, but not PY-STAT1, was significantly elevated in HCV-infected patients’ livers. U-ISGF3 was also significantly elevated in response to IFN-λ and IFN-β in HCV-infected primary human hepatocytes and Huh-7-TLR3 cells. Moreover, the U-ISGF3 components were detected in the nucleus of HCV-infected cells and livers. Chromatin immunoprecipitation revealed that U-ISGF3 is bound to the promoters of a subset of ISGs (U-ISGs) and prolongs their expression in HCV-infected cells and livers. Forced expression of IRF9, phosphorylation-defective STAT1, and STAT2 upregulated U-ISGs and restricted HCV chronic replication without exogenous IFN treatment. ISG15 is one of the U-ISGs, and high levels of U-ISGF3 and ISG15 paradoxically conferred unresponsiveness to IFN-α therapy by regulating USP18 protein level.
Taken together, I suggest that prolonged activation of ISGs in HCV-infected liver is mediated by U-ISGF3 which is induced by continuous IFN-λ stimulation including IFN- λ4, and upregulation of ISG15 by U-ISGF3 is critical in maintaing the protein level of USP18, leading to unresponsiveness to IFN-α. This novel mechanism of U-ISGF3-ISG15-USP18 axis in HCV-infected liver provides new insights into the treatment of chronic HCV infection.
C형 간염 바이러스는 전 세계적으로 1억 7천만명 이상이 감염되어 있으며, 만성 감염으로 이행하여 간경변이나 간암을 유발하는 주요 위험 인자이다. C형 간염 바이러스는 1989년 처음 동정된 후, 이의 병태 생리에 관한 많은 연구들이 이루어져 왔다. C형 간염 바이러스에 감염된 환자들의 치료 예후를 결정하는 숙주 인자로서 2009년에 처음으로 보고된 것이 인터페론 람다 유전자의 다형성이다. 이는 C형 간염의 만성 이행뿐만 아니라 인터페론 알파 치료의 반응 여부를 나타내는 중요한 지표로 여겨지고 있다.
2005년에 확립된 C형 간염 바이러스의 세포배양 모델은 그 동안 C형 간염 바이러스에 감염된 숙주 세포와 바이러스 간의 상호 작용에 관한 심도 깊은 연구를 가능하게 하였다. 현재까지 인체에서 일어나는 C형 간염 바이러스 감염 시 그 병태 생리를 유사하게 모방할 수 있는 실험 동물 모델은 없는 실정이다. 이에 본 연구자는 C형 간염 바이러스에 감염된 간 조직과 세포배양 모델을 이용하여 인터페론 람다가 C형 간염 바이러스와 숙주 세포에 미치는 영향에 대하여 연구하였다.
C형 간염 바이러스에 간세포가 감염되면 여러 바이러스 인지 경로를 통하여 감염된 세포로부터 인터페론 람다 및 베타가 생성, 분비된다. 이렇게 만들어진 인터페론은 다시 그 수용체와 결합하여 하위 신호 전달을 유도하는데, 이 때 발현이 증가하는 유전자들을 “인터페론자극유전자(interferon-stimulated Gene, ISG)” 라 한다. C형 간염 바이러스에 감염된 환자의 간에는 이러한 인터페론자극유전자의 발현이 증가되어 있는데, 특히 발현양이 많은 환자의 경우 인터페론 알파 치료에 대한 반응이 좋지 않은 것으로 알려져 있다. 본인은 인터페론 알파에 대한 반응성을 조절하는 특이 인자로서 기존의 인터페론 알파에 의한 signal transducer and activator of transcription (STAT) 단백의 인산화를 감소시키는 것으로 알려진 ubiquitin specific peptidase 18 (USP18) 단백에 주목하였다.
본 연구자는 C형 간염 바이러스에 감염된 환자의 간 조직에서 USP18 단백이 증가되었음을 관찰하였고, 인터페론 람다를 처리한 간암 세포주에서도 USP18 단백이 증가된 것을 확인하였다. 최근 이러한 USP18 단백의 안정성을 조절하는 인자로서 세포 내에 단독으로 존재하는(다른 단백과 결합하지 않고 또한 세포 밖으로 분비되지 않은) interferon-stimulated gene 15 (ISG15)에 관한 보고가 있었다. 본 연구자는 간염 바이러스에 감염된 환자의 간 조직과 인터페론 람다를 처리한 간암 세포주에서도 ISG15 단백과 mRNA가 증가해있으며, siRNA를 이용하여 ISG15의 양을 감소시키면 USP18 단백의 양도 감소하여 추가적으로 처리한 인터페론 알파에 대한 STAT 단백의 인산화가 회복되는 것을 확인하였다. 정리하면, C형 간염 바이러스에 감염된 간에서는 ISG15를 통한 USP18 단백의 발현 증가로, 치료용으로 사용한 인터페론 알파에 대한 반응성이 감소한다는 것을 확인하였다.
다음으로 C형 간염 바이러스에 감염된 간에서 ISG15의 조절에 관여하는 인자가 무엇인지 밝히는 연구를 진행하였다. 우선 선천 면역 기능을 회복한 간암 세포주(Huh-7-TLR3)를 제작하였으며, 또한 고역가를 지니고 있는 Japanese Fulminant Hepatitis 1 (JFH1) 바이러스를 제작하는 방법을 확립하였다. 이를 이용하여 고역가 JFH1 바이러스로 감염된 간암 세포주와 인체 유래 간세포에서 인터페론 람다와 베타가 생성되는 것을 확인하였다.
제 1형 혹은 3형 인터페론이 수용체에 결합하면 STAT 단백이 인산화되고 이렇게 인산화된 STAT1, STAT2와 interferon-regulatory factor 9 (IRF9) 단백이 결합하여 interferon-stimulated gene factor 3 (ISGF3) 복합체를 만들어 인터페론자극유전자의 전사를 유도한다고 알려져 있다. 최근 인산화되지 않은 STAT1과 STAT2단백도 IRF9과 결합하여 복합체를 만들 수 있고(이를 U-ISGF3라 명명) 이 또한 특정 종류의 인터페론자극유전자의 전사를 유도할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 U-ISGF3는 낮은 농도의 인터페론 자극이 지속될 때 세포내에 유도되어 기능을 하는 것으로 추정되고 있다. 이같은 결과를 바탕으로 본 연구자는 C형 간염 바이러스에 감염된 환자의 간 조직에서 인산화된 STAT단백과 인산화되지 않은 STAT 단백과 IRF9 단백의 발현을 조사하였고, 인산화된 STAT1 단백에 비하여 인산화되지 않은 STAT단백이 과량으로 존재함을 발견하였다. 위에서 확립한 간암 세포주와 인체 유래 간세포에 고역가의 JFH1 바이러스를 감염시켰을 때도 마찬가지로 U-ISGF3가 유도됨을 알 수 있었고, 또한 U-ISGF3에 의하여 유도되는 유전자(U-ISG)의 발현도 증가됨을 관찰하였다. 면역 형광 염색과 염색질 면역침강분석법을 통하여 U-ISGF3가 C형 간염 바이러스에 감염된 세포와 간 조직의 핵에 위치하여 U-ISG의 유전자 조절 부분에 결합하고 있다는 것을 발견하였다. 마지막으로 아무것도 처리하지 않은 간암 세포주에 IRF9, 인산화불능의 STAT1, STAT2를 과발현시켰을 때에도 마찬가지로 U-ISG가 유도됨을 확인하여 U-ISGF3의 존재가 U-ISG의 유도에 충분한 조건임을 확인하였다.
전반부에서 C형 간염의 치료 반응을 조절하는 것으로 밝힌 ISG15는 U-ISGF3에 의하여 발현이 조절되는 대표적인 유전자이다. 결론적으로, 본 연구자는 인터페론 람다에 의하여 생성된 U-ISGF3-ISG15-USP18 축이 C형 간염 바이러스가 감염된 간에서 인터페론 알파에 의한 치료 반응을 조절한다는 사실을 처음으로 증명하였다. 향후 이 연구 결과는 만성 C형 간염 및 만성 바이러스성 감염 질환의 치료에 중요한 이론적 단초를 제공할 것으로 기대된다.
