The large amount of fossil fuels has been consumed since industrialization began in the 18th century. In addition, the expenditure of fossil fuels is being increasingly accelerated by an exploding population, nowadays. Although fossil fuels drove economic growth and supported the conveniences of life, they also gave rise to serious environmental problems since carbon dioxide $(CO^2)$. Therefore, in order to meet the present level of energy demands and alleviate climate change, it is inevitable that fossil fuels must be replaced by renewable, sustainable, and eco-friendly next-generation fuel. Moreover, it should be used as transportation fuel in liquid form. Microalgae can capture light energy from the sun and convert carbon dioxide to organic matter by photosynthesis. Due to its high oil productivity and rapid growth potential, microalgae are used as feedstock for third generation biofuel, which has potential to replace petroleum fuels in the foreseeable future. Some microalgae species can uptake organic carbon sources as energy and nutrients for their growth and lipid induction. This type of cultivation mode is called heterotrophic or mixotrophic cultivation. Although microalgae grow much faster with high lipid accumulation than phototrophic cells, organic carbon sources are required. Therefore, heterotrophic and mixotrophic cultivations can be costly and less economically feasible. In order to decrease the costs associated with microalgal cultivation including the carbon source and nutrients, we must find inexpensive carbon and nutrient sources for microalgae cultivation. In chapter 3, we measured the growth of and lipid production by the model microalga Chlamydomonas reinhardtii under different phototrophic, heterotrophic, and mixotrophic conditions to determine the optimal conditions for growth and biodiesel production. In particular, we examined cell growth and yield of fatty acid methyl esters (FAMEs) when C. reinhardtii was cultured in the presence of different organic carbon sources (acetate, glucose, glycerol, and sucrose). C. reinhardtii grew under various conditions, but mixotrophic cultivation was best. The greatest biomass production ($2.15 gL^{-1}$ in 5 days) and FAME yield (16.41% of biomass) were observed under mixotrophic cultivation with acetate $(10 gL^{-1})$. As an alternative to acetate, we additionally tested the use of volatile fatty acids (VFAs; acetic, propionic, and butyric acids), which can be inexpensively produced through fermentation of food waste. The highest FAME yield (19.02% of biomass) and biomass production ($2.05 gL^{-1}$ in 5 days) were obtained with $5 gL^{1}$ of VFAs. This result indicates that VFAs can serve as an inexpensive alternative carbon source for maximizing lipid production in mixotrophic cultivation of C. reinhardtii. In chapter 4, the present study assessed the use of hydrolysate of lipid extracted algae (LEA) combined with the sugar factory wastewater (SFW) as a low cost nutrient and a carbon source, respectively for microalgal cultivation. Microalgal strain Ettlia sp. YC001 was both mixotrophically and heterotrophically cultivated using various amounts of hydrolysate and SFW. The culture which was grown in medium containing 50% LEA hydrolysate showed highest growth, achieving $5.26 ± 0.14 gL^{-1}$ after 12 days of cultivation. The addition of SFW increased the lipid productivity substantially from 5.8 to 95.5 $mgL^{-1}d^{-1}$ when the culture medium was fortified with 20% SFW. Gas chromatography analysis indicated a noticeable increase of 20% in C16 and C18 fraction in FAME distribution under above condition. Therefore, it can be concluded that the combination of LEA hydrolysate and sugar factory waste water can be a powerful growth medium for economical algal cultivation.
In chapter 5, we considered the usage of sugar factory wastewater (SFW) as an inexpensive carbon source for cultivation of heterotroph marine strain Aurantiochytrium sp. KRS101 for the production of docosahexaenoic acid (DHA). The highest biomass yield (20.03 $gL^{-1}$ in 5 days) was obtained using 30% of SFW in medium, which was higher than that of pure glucose control (concentration of glucose: 30 $gL^{-1}$). In addition, the biomass was maximized to 22.44 ± 0.41 $gL^{-1}$ in 5 days by optimizing the concentration of N and P sources to 20 $gL^{-1}$ of yeast extract and 9 $gL^{-1}$ of monopotassium phosphate, respectively. Lipid accumulation and composition are affected by chemical and physical environmental stimuli such as salinity, temperature, and medium pH. In order to increase the DHA yield with a large amount of biomass, sea salt was added to medium on different cell growth phase. The highest DHA yield (2.03 $gL^{-1}$ in 5 days) was obtained when we increase initial sea salt concentration from 15 $gL^{-1}$ to 35 $gL^{-1}$ at stationary phase. In this study, we confirmed Aurantiochytrium sp. KRS101 can be successfully cultivated heterotrophically using an alternative carbon source from wastewaters. Moreover, DHA yield can be increased by environmental stimuli such as salinity. We believe that these findings may have a significant impact on the future technology development for DHA production using Aurantiochytrium sp. KRS101
광합성 미생물인 $미세조류^{microalgae}$ 는 지구 상에 약 300,000종으로 추정되고 있고 종의 다양성만큼이나 여러 모습의 원료로 인류에게 이로움을 제공하고 있다. $슈퍼푸드^{superfood}$ 라 불리는 $클로렐라^{chlorella}$ 와 $스피룰리나^{Spirullna}$ 를 비롯하여 식물보다 성장 속도가 빠르고 지질 함량이 높은 종은 신 재생 에너지인 바이오 $디젤^{diesel}$ 생산에 사용되고 있다. 특히 기존의 석유화학 인프라를 이용해 미세조류 바이오매스 기반 $플랫폼 소재^{Platform chemiclas}$ 를 생산하여 안정적으로 공급할 수 있을 뿐만 아니라 인간에게 필요한 의약품이나 화장품 원료인 항암물질, 항산화 물질 같은 $고부가 가치 유용 물질^{vlaue-added products}$ 등도 미세조류부터 생산할 수 있다. 이런 미세조류를 이용한 바이오 디젤 및 고부가가치 유용물질 생산기술의 핵심은 $원료^{feedstock}$ 학보를 위한 고농도 미세조류 $배양^{cultivation}$ 과 동시에 바이오 디젤의 가격 경쟁력 향상을 위한 배지 가격 $절감^{cost reduction)에 있다. 본 연구는 이를 목적으로 다음과 같은 연구를 진행하였다.
우선, chapter 3에서는 바이오매스 및 지질 함량을 향상 시키기 위해 유전자 변형에 주로 사용되고 있는 종인 Chlamydomonas reinhardtii를 이용하여 $자가영양^_{autotroph}$, $종속영양^{heterotroph}$, $혼합영양^{mixotropg} 배양방법에 따른 셀의 성장 및 지질 함량 변화를 살펴보았고 그 결과 자가영양 배양방법보다 기질을 추가적으로 사용하는 종속영양 및 혼합영양 배양방법에서 미세조류의 높은 성장률과 지질 함량을 보이는 것을 확인하였다. 그리고 C. reinhardtii의 다양한 기질의 선호도를 알아보기 위하여 4 가지 종류의 $유기탄소원(아세테이트^{acetate}, 포도당^{glucose}, 과당^{fructose}, 설탕^{sucrose})$ 을 사용하였으며 그 결과 C. reinhardtii는 빛이 있는 조건에서 아세테이트를 가장 선호하는 것으로 확인되었다. 하지만 기존의 배양에서 아세테이트 같은 유기탄소원을 추가로 사용하였을 시 미세조류의 생장과 지질의 함량은 높아지지만 배지의 가격도 그 만큼 상승한다. 그래서 기존의 셀 성장과 지질 함량을 유지하면서도 경제적인 배양을 위한 방법으로 아세테이트의 함량이 $높은 휘발성 지방산^{Volatile fatu acid$ 을 저가 탄소로 사용하였다. 휘발성 지방산은 폐기물로부터의 혐기소화를 통해 나오는 부산물로서 폐물에 종류에 따라 다양한 아세테이트 비율을 가지고 있다. 이번 실험에서 사용된 휘발성 지방산(아세트산 : 프로피온산 : 부티르산 = 8 : 1 : 1)은 아세테이트 비율이 높은 휘발성 지방산으로 아세테이트를 대체하여 저가 기질로 사용하였다. 휘발성 지방산을 이용한 C. reinhardtii 배양 실험결과 아세테이트 10 g/L를 단독으로 사용하였을 때보다 저가 기질로 휘발성 지방산을 5 g/L 사용하였을 때 더 높은 셀 건조 중량 과 지질을 얻을 수 있었다. 이번 실험을 통하여 미세조류의 유기탄소 선호도를 확인하고 그에 맞는 저가 기질을 사용함으로써 경제적인 고농도 미세조류 배양을 실시할 수 있었다.
다음으로 chapter 4에서는 앞서 배양의 가격을 낮추기 위한 저가 탄소를 이용한 방법의 일환으로 배지 영양분 중 질소와 인을 대체하는 실험을 Ettlia sp. YC001를 가지고 실시 하였다. 미세조류의 배양 가격을 낮추기 위해서는 저가 영양분의 공급이 필요한데 본 실험에서는 앞으로 미세조류 산업이 커짐에 따라 발생하는 양도 많아 지게 될 폐기물인 지질 추출 후 남은 잔여 바이오매스를 당화 를 시켜 다시 미세조류 배양의 질소, 인 영양분으로 사용하였다. 우선 미세조류 지질 추출 후 남은 잔여 바이오매스 를 가지고 영양분을 얻기 위하여 염기를 이용하여 당화를 실시하였다. 염기는 일반적으로 사용되는 수산화나트륨 용액을 사용하였고, 저가 영양분을 준비하는 과정은 다음과 같다 지질 추출 후 남은 바이오 매스를 0.1 M 수산화나트륨 용액으로 당화를 실시한 후 다시 인산을 이용하여 중화를 실시하였다. 이는 인산을 이용하여 미세조류 당화물을 중화시킬 수 있으며 인산(H3PO4)에 있는 인(PO43-)을 다시 미세조류가 사용할 수 있도록 이 방법을 사용하였다. 이 방법을 통해 얻은 저가 영양분인 미세조류 당화물은 미세조류가 성장하기에 충분한 질소와 인 영양분을 함유하고 있었으며 기존에 흔히 사용되는 BG11배지와 비교하여 보았을 때 보다 훨씬 높은 미세조류의 성장을 보였으나 지질 함량은 보이지 않았다. 그래서 추가적으로 기존의 높은 셀 농도를 유지하면서 지질의 함량의 향상을 유도하기 위하여 새로운 저가 탄소원인 설탕공장폐수를 도입하였고 그로 인해 기존의 배지 보다 더욱 더 저렴한 배지인 미세조류 당화물을 이용하여 배양함과 동시에 설탕공장폐수를 사용하여 더 높은 지질 함량을 꾀할 수 있었다. 이번 실험을 통하여 미세조류 생장에 필요한 배지의 기본 영양분인 탄소원, 질소, 인 영양분을 산업폐기물로 대체 함과 동시에 경제적인 바이오 디젤을 생산할 수 있었다.
마지막으로 chapter 5에서는 앞서 chapter 3, 4에서는 산업폐기물을 이용한 경제적인 바이오 디젤 생산에 집중하였다면 이번 실험에서는 미세조류를 이용한 바이오 디젤 생산뿐 아니라 건강보조식품으로 알려진 오메가 3지방산인 DHA (docosahexaenoic aicd)를 생산하였다. DHA는 오메가 3 지방산으로 혈액의 피막형성을 억제하고 뼈의 형성을 촉진 및 강화하는 것으로 알려져 있고 성장기 어린아이의 두뇌발달에도 도움이 되는 것으로 보고되고 있다. 본 실험을 위해 사용한 Aurantiochytrium sp. KRS101은 포도당을 사용하는 종속영양 종으로 바이오 디젤뿐 아니라 오메가 3 지방산을 생산하는 것으로 알려져 있다. 종속 영양 종이기 때문에 많은 기질의 양이 들어가는데 이 배양 가격을 높이는 요인을 앞서 사용한 설탕공장폐수를 이용하여 최적화 실험을 우선적으로 시작하였다. 포도당을 대체하여 다양한 농도 (0~100%)의 설탕공장폐수를 이용하여 미세조류를 배양 한 결과 배지의 30%를 저가 탄소로 대체 하였을 때 가장 높은 바이오 매스와 지질 함량을 확인할 수 있었고 (바이오매스: 19.55 g/L, 지질: 36.48%), 이 결과는 포도당을 30 g/L로 사용하였을 때 (바이오매스: 9.28 g/L, 지질: 10.61%)보다 높은 수치였다. 이것을 기본으로 배양 최적화를 위한 질소와 인 양을 조절하는 실험을 진행하였다. 실험결과 기존의 배지보다 질소 원이 2배로 인은 1배로 들어갔을 때 가장 높은 바이오 매스 (22.44 g/L)를 얻을 수 있었으나 생장에 에너지를 집중해서인지 지질은 상대적으로 낮아지는 결과를 보였다. 지질이 낮아지는 현상을 보완하기 위한 실험으로 스트레스에 의한 지질 함량을 높이는 실험 적용하기로 하였다. 우선 지질 향상에 대한 가장 효과적인 스트레스를 확인하기 위하여 다양한 스트레스를 가지고 실험을 실시하였다. 스트레스의 종류로는 온도, 염도, pH, UV를 가지고 실험을 하였으며 그 결과 여러 스트레스 중 바이오 매스와 지질 함량 향상에 가장 높은 영향을 미쳤던 것은 염도였다. 이 결과를 토대로 기존의 설탕공장폐수를 사용하였던 실험 조건에 적용하여 보았다. 그 결과 상대적으로 많은 양의 지질의 향상을 확인하지 못하였지만 DHA 함량은 소폭 상승한 것을 확인할 수 있었다. 이 실험을 통하여 기존의 포도당을 사용하였을 때 보다 저렴한 설탕공장폐수를 사용함으로 경제적인 배양을 꾀할 수 있었을 뿐만이라 DHA 함량도 1.02 g/L에서 2.03 g/L가량 약 2배로 높일 수 있었다.
지금까지의 실험을 통하여 산업 폐기물로 알려진 휘발성 지방산이나 지질 추출 후 잔여 바이오매스 그리고 설탕공장폐수는 미세조류의 생장과 지질 함량을 높이는 데에 효과적임을 확인 할 수 있었다. 추가적인 경제성 평가를 수반하여 지속적인 연구가 진행된다면 앞으로 미세조류 배양 가격 경쟁력 향상에 더욱 도움이 되리라 생각된다
