Currently, antibodies that play a major role in treating a wide variety of human diseases (e.g., cancer, viral infection, inflammation) have become major therapeutic reagents in the pharmaceutical drug market. In addition to full-length antibodies, the development of antibody fragments, which also offers potential ad-vantages in clinical use as well as diagnostics, is gradually growing. As the demand for antibody therapeutics increase, the development of host systems for enhanced and less expensive production has also become more important. Most of antibody therapeutics approved to date is predominantly produced in mammalian hosts, but due to drawbacks such as high production cost and long-term cultivation, the alternative use of bacteria has been seriously considered. Among various bacteria, Escherichia coli is one of the most feasible host for antibody production, because of its well-known and robust features. Indeed, E. coli has been widely utilized for the production of antibody fragments, but in many cases, it has been frequently faced with the limitations of low production yield and secretion efficiency. Moreover, production of full-length antibody has been regarded as more difficult problem due to the large size, complex structure and lack of glycosylation.
In this study, to suggest generic solutions for those problems, various strategies were examined and inten-sively studied. Firstly, to facilitate the secretion of antibodies in E. coli, SRP-dependent secretion pathway, instead of conventional Sec-dependent pathway, was utilized and engineered. The SRP pathway has a great feature of co-translational translocation, thus it was expected that the cytoplasmic aggregation of antibodies could be prevented. Indeed, expression level of scFv and IgG was increased by simple changing of secretion pathway (using SRP instead of Sec). In addition to the utilization of SRP pathway, co-expression of the SRP pathway-related factors (i.e., ffh, ftsY, yidC) and/or folding assistants (i.e., dsbC, dsbA, skp) was conducted to improve the secretion and folding efficiency. As a result, scFv and IgG were increasingly produced through the SRP pathway in E. coli.
Secondly, to lead the significant increase of antibody expressions, two kinds of cellular engineering were conducted. To facilitate binding between ribosome and mRNA, 5’ and/or intergenic untranslated region (UTR) sequences were modified and the effects were investigated. In addition, single gene (rnpA) knockdown, which offers higher stability of antibody-encoding mRNA, was introduced. For the results of the both strate-gies, production yields of IgG were dramatically increased. Moreover, knockdown of rnpA also led the en-hanced production of Fab fragment.
Finally, to improve the performance of SRP-dependent pathway in E. coli, I developed a novel E. coli mu-tant through the FACS-based directed evolution technique. For this experiment, I developed a new fluores-cent reporter system, which can visualize the periplasmic expression level of target protein, by using a special fluorescent dye, FlAsH-EDT2. Using these strategies, transposon-mediated E. coli mutant library was screened, and so, single copy of 16S rRNA (rrsE) knock out mutant was isolated. With this mutant, several model proteins (i.e., MBP, DsbA, TorT, TolB) were increasingly expressed and secreted through the SRP pathway. Moreover, the production yield of antibodies (i.e., IgG, scFv) and G protein-coupled receptor were dramatically increased since the great effect of isolated mutant.
항체는 외부로부터 바이러스나 박테리아, 독소 등의 침입에 가장 먼저 또 가장 효과적으로 대응하는 인체의 중요한 방어수단으로서, 가장 큰 시장규모를 갖고 있는 고부가 의약품이다. 그러나 두 개의 중쇄 (H chain)와 경쇄 (L chain)로 구성되는 복잡한 구조, 거대한 크기 그리고 면역 작용기능 (immune effector function)을 위해 요구되는 글리코실화반응 (glycosylation)의 부재 등의 문제로 인해 현재 거의 모든 항체 생산은 고비용의 동물세포를 이용하여 이루어지고 있다. 반면에 저비용 생산이 가능한 대장균의 경우 그 동안 수많은 재조합 단백질 생산에 숙주세포로 이용되어 왔음에도 불구하고 글리코실화반응이 일어나지 않는 한계점 때문에 항체 생산에 이용되지 못하여 왔다. 그러나 최근에 글리코실화반응 없이도 면역 작용기능을 보이는 항체 변이체가 개발되었으며, 이는 대장균을 항체 생산에 이용할 수 있는 가능성을 열어 주었다. 또한 특정 질병에 대해서는 글리코실화 되지 않은 항체가 더 효과적으로 작용할 수 있기 때문에 대장균을 이용한 항체 생산이 점점 더 큰 관심을 받고 있다. 대장균을 이용하여 항체를 생산하게 되면, 짧은 생산 시간 및 저가의 배지 사용 등으로 인해 생산 비용을 획기적으로 절감할 수 있다. 그러나 아직까지 대장균에서의 항체 생산은 충분히 연구되지 않았으며, 생산 수율이 매우 낮은 수준에 머물러 있다. 낮은 생산 수율을 보이는 가장 큰 이유 중 하나는, 항체 생산 시에 대장균의 내막을 통과해야 하는 단백질 분비과정을 수반하기 때문이다. 대장균의 세포질은 환원적 환경으로, 디설파이드 결합 (disulfide bond)을 형성하기에 부적합 하기 때문에, 올바른 형태로 항체를 생산하기 위해서는 산화적 환경을 제공하는 주변세포질에 분비 생산하여야 한다. 이렇듯 대장균에서 고효율로 항체를 생산하기 위해서는 분비생산경로의 개량을 통한 분비 효율의 개선이 가장 시급한 해결 과제라 할 수 있다.
따라서, 본 연구에서는 대장균의 SRP 분비경로 (신호인식입자의존 분비경로; SRP-dependent se-cretion pathway)를 도입하여 새로운 항체생산 시스템을 구축하였다. SRP 분비경로를 통해 단백질을 분비생산 시키면 단백질이 발현됨과 동시에 분비가 일어나는데, 이러한 특성은 단백질이 분비되기 전에 세포질 내에서 엉기는 현상 (cytoplasmic aggregation)을 효과적으로 방지해 줄 수 있다. 실제로 단일사슬 항체단편 (scFv)과 전분자 항체 (IgG)의 생산을 위해서 SRP 분비경로를 도입하였을 때 더 많은 양의 항체단편 혹은 항체가 분비생산 되는 것을 확인할 수 있었다 (CHAP-TER 2 and 3). 또한, SRP 분비경로와 밀접한 관련이 있는 단백질들을 함께 발현시킴으로써 더 높은 항체 생산 수율을 얻을 수 있었다. 단일사슬 항체단편의 경우 YidC를, 전분자 항체의 경우 Ffh를 공동발현 (co-expression) 시켰을 때 가장 효과적인 분비생산이 일어나는 것을 확인하였다. 전분자 항체의 경우 4개의 폴리펩티드가 서로 결합하여 4차 구조를 형성해야 하기 때문에 단백질 분비뿐만 아니라 올바른 구조형성도 중요한 요인이다. 이를 돕기 위해 DsbC를 추가적으로 공동발현 시킴으로써 더 높은 전분자 항체 생산 수율을 얻을 수 있었다. 이렇게 구축된 항체생산 시스템을 이용하여 세포고농도 배양을 진행한 결과 90 mg/L의 단일사슬 항체단편의 생산 수율 및 62 mg/L의 전분자 항체의 생산 수율을 얻을 수 있었다.
더 많은 단백질이 분비생산 되기 위해서는 우선 많은 양의 단백질 발현이 선행되어야 하기 때문에, 항체분자의 고효율 발현에 대한 연구를 수행하였다. UTR (untranlated region) 서열은 유전자의 전사 이후 번역과정에서 리보솜이 RNA에 결합하는 효율을 결정하는 대 아주 중요한 역할을 하는데, 이를 개량하여 항체분자의 발현량을 크게 증가시킬 수 있었다 (CHAPTER 4). 또한 앞서 언급한 것과 같이 DsbC를 공동발현 시킴으로써 인간 전분자 항체의 생산 수율을 극대화 시킬 수 있었다. UTR 서열을 변형시킨 항체발현 시스템을 이용하여 세포고농도 배양을 진행한 결과 362 mg/L의 생산 수율을 발현유도 후 14시간 내에 얻을 수 있었다. 이는 7일 내지는 20일간의 동물세포 배양을 통해 얻을 수 있는 수 g/L 수준의 생산 수율과 비교하면 훨씬 더 효과적인 결과라 할 수 있다. UTR 서열의 개량뿐만 아니라 mRNA의 분해를 억제함으로써 항체 생산 수율을 증가시키는 연구도 진행하였다. 항원결합 조각 (antigen binding fragment, Fab)이나 전분자 항체를 생산하기 위해서는 light chain과 heavy chain이 각각 발현되어야 하는데, 이를 위해서 길이가 긴 bicistronic 전사체를 만들게 된다. 길이가 긴 mRNA는 효소에 의한 공격을 받기 쉬운데, 이를 중재하기 위하여 mRNA 분해에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 RNase P의 단백질 부분 (RnpA)의 발현을 억제함으로써 더 높은 항체 생산 수율을 얻을 수 있었다 (CHAPTER 5). RnpA 발현이 억제된 대장균주를 이용하여 항원결합 조각 생산을 위한 세포 고농도 배양을 진행한 결과 야생균주에 비해 훨씬 많은 항원결합 조각이 생산된 것을 확인할 수 있었다.
마지막으로 SRP 분비경로의 제한된 용량을 극복하기 위해서 새로운 대장균주 변이체를 발굴하였다. SRP 분비경로는 본래 매우 한정된 단백질의 분비생산을 위해 존재하기 때문에 너무 많은 양의 재조합 단백질을 분비생산 시키면 세포 성장에 저해를 받는 등의 문제가 발생한다. 이러한 이유 때문에 재조합 단백질의 분비생산을 위해서는 일반적으로 Sec 분비경로를 많이 사용하지만, 항체와 같이 크고 복잡한 구조를 갖는 단백질은 SRP 분비경로를 이용할 때 훨씬 더 효과적으로 분비시킬 수 있기 때문에 SRP 분비경로를 통해 많은 양의 재조합 단백질을 분비시킬 수 있는 대장균주 변이체를 발굴하게 되었다. 먼저, FACS (형광이용세포분리기) 기반의 초고속 스크리닝 기법을 이용하기 위해서 주변세포질에 발현된 목적 단백질을 선택적으로 표지할 수 있는 새로운 방법을 고안하였으며, 이를 기반으로 트랜스포존을 이용해 제작된 대장균주 라이브러리를 스크리닝 하였다. 그 결과 16S 리보솜 RNA 유전자 (rrsE)가 결실된 대장균주 변이체를 발굴하였으며, 이 변이체가 다양한 재조합 단백질의 SRP 의존 분비생산을 효과적으로 증가시키는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 인간 전분자 항체를 생산하기 위한 세포 고농도배양을 수행한 결과 매우 높은 항체 생산 수율 (총 401.9 mg/L; 주변세포질 165.4 mg/L, 상등액 236.5 mg/L)을 얻을 수 있었다. 또한 중요한 의약단백질로 알려져 있는 GPCR의 생산량 또한 극대화 시킬 수 있었으며, 세포 고농도배양을 통해 1.39 g/L의 매우 높은 생산 수율을 얻을 수 있었다.
