Many proteins exert their biological roles as components of complexes, and the functions of proteins are often determined by their specific interactions with other proteins. Therefore, the ability to control protein-protein interactions provides a powerful tools for molecular diagnostics, cell-based biosensors, therapeutics, and industrial biotechnology. In this study, we developed affinity-controllable protein binder based leucine-rich-repeat (LRR) module protein.
Chapter 1 describes the development of pH-sensitive protein binder and its application for affinity purification of human immonuglobulin antibodies. The importance of a downstream process for the purification of antibodies is increasing with the growing application of monoclonalantibodies in many different areas. Althogh protein A is the most commonly used for the affinity purification of antibodies, certain properties could be further improved: milder elution condition and higher stability in alkaline solution. Herein, we present the development of Fc-specific repebody by modular engineering approach and its potential as an affinity ligand for purification of human IgG. The developed repebody was shown to be loss of binding affinity at mild pH (pH 4.0). Also, the repebody remained almost intact even after incubation with harsh pH conditions.
In Chapter 2, we have first demonstrated photo-switchable scaffold protein using photo-isomerizable ligand. Photo-switchable proteins are powerful tools to control biological processes with the spatial and temporal precision of light. Unfortunately, such proteins exist only for specific cases of proteins and general ligand which can bind variable targets has not developed. Here, we describe the development of photo-switchable repebody by computational design and its potential as a light-controlled binder. We expect that developed photo-switchable repebody scaffold can be used to the robust and general application for light-controlled biological studies.
결합력을 조절할 수 있는 류신 반복 모듈 기반의 결합 단백질 설계
단백질은 각각의 고유의 생물학적 역할을 가지고 있다. 각각의 단백질의 기능은 다른 단백질들과의 결합에 의해 결정된다. 때문에 단백질 간의 결합력을 조절할 수 있는 것은 분자 진단이나 세포 기반 바이오센서, 치료제, 바이오 산업등 다양한 분야에 널리 사용될 수 있는 획기적인 기술을 제공할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 표적 단백질과의 결합력을 외부 요인에 의해 조절할 수 있는 골격 단백질을 개발하였고 이를 이용한 다양한 응용 가능성에 대해 연구를 수행하였다.
제 1장에서는 pH 변화에 따라 항체와의 결합력이 민감하게 변화되는 골격 단백질을 개발하였다. 파지 디스플레이 메소드를 통해 인간 항체와 적당한 결합력을 가지고 있는 골격 단백질을 확보하였고 확보한 단백질이 pH의 변화에 결합력의 변화가 크다는 것을 확인하였다. 이를 이용해 본 연구에서는 실제 항체 정제 레진을 제작하였고, pH 4의 약 산성에서 충분히 항체를 정제한다는 것을 확인하였다. 또한 CIP 처리에서 주로 사용되는 강염기 조건에서 15일 이상의 안정성을 가지는 것을 검증하였다. 기존 항체 정제 시스템은 낮은 pH 조건에서만 항체의 정제가 가능하고 때문에 생산되는 항체의 품질이 떨어질 수 있다는 단점이 있었다. 또한 CIP 처리에서 리간드의 불안정성을 일으켜 레진 사용의 수명이 단축된다는 단점을 가지고 있다. 본 연구에서는 개발한 골격 단백질은 이런 기존 시스템의 문제를 해결할 수 있는 새로운 항체 정제 시스템 구축을 가능케 했다.
제 2 장에서는 빛에 의해 표적 단백질과의 결합을 조절할 수 있는 LRR 기반의 결합 단백질을 설계 및 개발하였다. LRR 단백질은 모듈 기반의 구조적 특징으로 매우 안정하고 각 모듈간의 독립적인 기능이 가능하다. 이러한 LRR 단백질의 특징을 이용하여 광이성질체 물질인 BSBCA를 LRR 골격 단백질과 결합하여 빛에 의해 표적 단백질과의 결합력이 조절되는 결합 단백질을 개발하고자 하였다. 이를 위해 LRR 골격 단백질인 리피바디의 구조를 기반으로 하여 MD 시뮬레이션을 수행하였다. 시뮬레이션을 통해 확보한 리피바디들이 모두 빛에 의해 표적 단백질과의 결합력이 달라진다는 것을 다양한 실험적 방법을 통해 확인하였다. 확보한 리피바디들은 광유전학 기술을 포함한 다양한 분야에 널리 사용될 것으로 예상된다. 또한 설계한 시뮬레이션 메소드를 이용하여 다른 LRR 단백질들에 적용, 쉽게 광이성질체 단백질을 확보할 수 있을 것으로 예상된다. 이는 기존 광이성질체 단백질 확보에 어려움을 해결할 수 있을 것이라고 보여진다.
위의 연구들을 통해 외적 요인에 의해 결합력이 조절되는 골격 단백질들을 확보하였고 이를 설계할 수 있는 메소드를 설립하였다. 이는 산업 및 의약 분야에 널리 활용 될 수 있을 것으로 기대된다.
