Long-term synaptic plasticity is controlled by balanced actions of positive and negative regulators at synapses. Protein kinase $C_\alpha$ ($PKC_\alpha$) is a critical mediator that induces long-term depression (LTD) at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. However, the precise regulation of $PKC_\alpha$ for LTD is not well understood. Here, I investigated the role of diacylglycerol kinase $\zeta$ (DGK$\zeta$) - a kinase that physically interacts with $PKC_\alpha$ as well as postsynaptic density protein 95 (PSD-95) family proteins and functionally inhibits $PKC_\alpha$ by metabolizing diacylglycerol (DAG) - in the regulation of cerebellar LTD. In Purkinje cells of DGK$\zeta$-deficient mice, LTD was impaired and $PKC_\alpha$ was less localized in dendrites and synapses. This impaired LTD was rescued by virus-mediated expression of wild-type DGK$\zeta$, but not by a kinase-dead mutant DGK$\zeta$ or a mutant lacking the ability to localize at synapses, indicating that both the kinase activity and synaptic anchoring functions of DGKζ are required for LTD. In addition, experiments using another DGK$\zeta$ mutant as well as immunoprecipitation analysis revealed an inverse regulatory mechanism, in which $PKC_\alpha$ phosphorylates, inactivates, and then is dissociated from DGK$\zeta$, is required for LTD. These results indicate that DGK$\zeta$ is targeted to synapses, through its interaction with PSD-95 family proteins, to facilitate synaptic localization of $PKC_\alpha$, but maintains $PKC_\alpha$ in a minimally activated state by reducing local DAG until its activation and release from DGK$\zeta$ during LTD. Such local and reciprocal regulation of positive and negative regulators may contribute to the fine tuning of synaptic signaling.
시냅스 가소성의 한 종류인 소뇌 장기저하 (cerebellar LTD)는 여러 신호전달 경로에 의해 유도된다. 하지만, 소뇌 장기저하의 신호전달에서 PKC와 같은 중요한 positive regulator들의 존재가 잘 알려져 있음에도 불구하고 그 활성이 어떻게 정교하게 조절되는지, negative regulator와는 어떤 방식으로 상호작용하는지 알려진 바가 거의 없다. Diacylglycerol kinase (DGK)는 PKC를 활성화시키는 지질 신호 전달 분자인 Diacylglycerol (DAG)을 인산화하는 효소이며, 특별히 DGK $\zeta$ isoform은 PSD-93 단백질과 결합하여 흥분성 시냅스로 타겟팅 된다. 또한, DGK $\zeta$ 는 $PKC_\alpha$ 와도 물리적으로 결합하여 $PKC_\alpha$의 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 DGK $\zeta$ 가 소뇌 퍼킨지 세포 시냅스에서 $PKC_\alpha$의 활성을 어떻게 조절하고 결과적으로 소뇌 장기 저하의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. DGK$\zeta$ 유전자 결손 생쥐에서는 야생형 생쥐와 다르게 소뇌 장기저하의 유도가 일어나지 않았고, 시냅스로 타겟팅된 PKCα가 줄어있음을 관찰하였다. DGK $\zeta$ 단백질이 PSD-93과 결합하는 부위를 제거한 돌연변이 단백질($\Delta$D) 또는 효소활성을 없앤 돌연변이 단백질(KD)을 바이러스를 이용해 유전자 결손 생쥐에 재발현시키면 야생형 단백질과는 달리 LTD가 복구되지 않았으며, 이것은 DGK $\zeta$ 의 시냅스 타겟팅과 효소활성 모두가 소뇌 장기저하에 필요함을 의미한다. 마지막으로 소뇌 장기저하가 발현되는 동안에는 $PKC_\alpha$ 에 의한 DGK $\zeta$ 의 인산화와 이어지는 두 단백질 간 결합의 해체가 필요하다는 것을 immunoprecipitation analysis를 통해 확인하였고, $PKC_\alpha$ 에 의한 DGK $\zeta$ 의 인산화가 억제된 DGK$\zeta$ 돌연변이(SN) 단백질의 재발현은 유전자 결손 생쥐의 장기저하 손상을 복구하지 못했다. 종합하면, DGK $\zeta$ 는 PSD-93 단백질과의 결합을 통해 시냅스로 타겟팅되며 이 때 $PKC_\alpha$ 가 시냅스에 위치하는 것을 도와준다. 하지만, 특정 형태의 자극이 들어오기 전에는 DGK$\zeta$ 의 효소활성을 통해 PKCα의 활성화가 억제되고, 장기저하가 발현될 때에만 DGK$\zeta$ PKCα로부터 떨어져 나간다. 이러한 DGK $\zeta$ 와 $PKC_\alpha$ 의 상호작용은 시냅스 내에서 시냅스 가소성을 유도하고 발현시키기에 최적의 조건을 설정하는 정교한 신호전달 반응이며, 시냅스 가소성의 특정자극 의존성을 설명할 수 있는 단서가 될 것이다.
