The pH dependent binding of α-lactalbumin to the phospholipid vesicles was studied sedimenting the vesicles after the chemical equilibrium was reached. Unilamellarity of these vesicles was checked by electron microscopy.
Binding reactions carried out in 10 mM buffers at several pH values with and without added NaCl. The amount of binding of α-lactalbumin to the vesicles in the 10 mM buffers showed maximum at pH 4 through the each pH range : (pH7-2). However, at 100 mM ionic strength(90 mM NaCl and 10 mM buffer), the binding affinity increased with decreasing pH value and the rate of decrease was steepest between pH value of 3 and 4. The binding was found to be reversible at pH 4 but it was irreversible at pH 2. It appears that, therefore, at pH ranges below 4, hydrophobic interactions are involved for the binding reaction. The pH dependent structural changes of secondary and tertiary structure of α-lactalbumin were also studied by monitoring the circular dichroism spectra. The difference ultraviolet spectra and fluorescence spectra were also used to determine the pH dependent structural changes of α-lactalbumin.
It was found that there is a close relationship between the binding affinity and the extent of the formation of the "molten globular structure" of α-lactalbumin.
α-LA 과 인지질막은 세포내에서 세포막과 단백질 사이의 상호작용 기구의 연구를 위해서 model system 으로 사용되었다.
α-LA 의 liposome 에의 결합을 pH 2 에서 pH 7 까지 정량적으로 측정하였다. 결합반응시의 온도는 18℃ 였다. NaCl 염을 사용하여 이온 세기를 변화 시켜서 결합을 측정한 결과 10 mM 이온세기 에서는 α-LA의 인지질막 결합양은 pH 4 에서 최대였고, (liposome 직경을 200 nm 로 관찰 되었으므로 7,000 분자수의 최대 결합 부위를 갖음) 그러나 100 mM이온 세기 (90 mM NaCl 포함) 에서는 pH 2 에서 최대였고 pH 3 과 pH 4 사이에서 급격한 감소를 보였다.
pH 4 에서는 결합의 가역성을 보였으나 pH 2 에서는 결합된 α-LA 의 30% 가량이 비가역적으로 인지질 층 내에로 삽입되어 있음을 보였다. pH 에 따른 α-LA 의 구조 변화를 C.D spectra로 관찰한 결과 $[θ]^p_{270}$ 값이 pH 2 에서 가장 최소였다. 즉 aromatic 기의 환경이 native α-LA (pH 7.0) 에 비해 more symmetric 해 졌음을 보인다. 그리고 pH 3 과 4 사이에 급격히 증가했다. 그러나 2 차 구조는 (195 - 240 nm) 안정된 구조를 보였다. Difference UV spectra에서도 $A_{291}$ nm 의 pH 의존 단면이 C.D (near UV range) spectra 와 유사한 shape 을 보였다.
α-LA 을 liposome과 mixing 했을때 trp 기의 형광 강도가 pH 7 에서 pH 2 로 갈수록 증가 함으로서 trp 기가 인지질 층으로 들어가는 것을 보인다. 이와같은 결과로서 생리적 조건에서 peripheral protein으로 알려진 α-LA 이 pH 가 4 에서 2 까지 감소될 수록 (molten globular form)의 증가와 함께 인지질막의 지질층 으로 intercalation 되는 양의 증가를 보였다.
