Lymphocytes were isolated from human periperal blood by Ficollpaque and immune interferon was induced in isolated lymphocytes in culture by combined treatment with a phorbol ester (12-o-tetracanoylphorbol 13-acetate, TPA) and Concanavalin A. Total RNA was isolated from mononuclear cells induced with TPA and Con A, and passed through oligo-(dT)-cellulose column to obtain mRNA. Poly(A)-containing RNA was transcribed into cDNA by AMV reverse transcriptase under appropriate conditions which increase the yield of full length cDNA.
After alkaline hydrolysis of mRNA, the second cDNA strands were synthesized with hairpin loop as a primer.
The loop of the ds-cDNA was specifically cleaved under appropriate conditions. cDNAs larger than 700 bp were purified on a preparative agarose gel. After a tailing step with dCTP, cDNAs were annealed to plasmid DNA tailed with dGTP. Recombinant plasmid DNAs were transformed in $\underline{E}. \underline{coil}$ LE392.
인체말단 혈류로부터 림파구를 Ficoll-paque를 사용하여 분리하였다. TPA, conA 를 처리하여 분리된 림파구 세포에 감마인터페론을 생성하도록 유도하였다.
임파구를 24시간 배양한 후 원심분리하여 리보 핵산을 추출하였다. 전체 리보핵산을 oligo-(dT)-cellulose 컬럼에 통과시켜 poly(A)을 포함하는 리보핵산을 얻었고 이것을 주형으로 하여 제일차 cDNA 가 가능한 온전하게 보전되어 전사되도록 하는 상황하에서 역전사 효소를 이용하여 제일차 cDNA 합성하였다.
제일차 cDNA의 mRNA를 가수분해하고 두 가닥의 cDNA를 합성한 다음 뉴클오타이드가 700개보다 많은 cDNA를 알카로즈 젤 상에서 취하였다. cDNA의 3' 부분에 20-30 개의 CMP 잔기를 붙히고 GMP 잔기가 붙어있는 벡터와 annealing 을 하였다. 이 재조합 플라스미드를 대장균에 형질전환을 하였다.
