Both cultural conditions and analytical methods were tried to vary in order to obtain a high frequency in genetic recombination through protoplast fusion. Three types of auxotrophic mutants of $\underline{Bacillus}$ $\underline{subtilis}$, BD 170 (trpC 2, thr-5), NA 64 (met, ade), and RM 125 (leuA 8, arg-15), were used as test organisms.
Cells grown in nutrient broth were subjected to protoplasting. Transferring cells at the late log phase always gave better results. It was also found that growing the cells under hypertonical conditions was better for the subsequent protoplast regeneration. Adding various osmotic stabilizers such as sucrose (0.5 M), NaCl (0.5 M), sorbitol (0.5 M) or sodium succinate (0.33 M) to the nutrient broth separately, increased the regeneration frequency by 10-fold.
For the regeneration medium additions of 1.5% agar and 3% PVP to the basal medium (DPA medium without horse serum and agar) could improve the regeneration rate. The use of casein hydrolysate as nitrogen source in the regeneration medium was found to be indispensable. The replacement of casein hydrolysate with other nitrogen sources such as ammonium bisulphate and yeast nitrogen base decreased regeneration efficiency drastically; only $\frac{1}{80}$ to $\frac{1}{120}$ of that obtained on casein hydrolysate containing medium.
The naked protoplasts could regenerate better when they were plated on the regeneration agar premixed in soft agar (0.5%) to make a thin layer on the top of the solid agar medium instead of being plated out directly. The regeneration efficiency increased by 50-fold through the thin layer method.
Applying the optimal conditions obtained, fusion between protoplasts originated from the three auxotrophs of $\underline{B}$. $\underline{subtilis}$ was performed. The results were evaluated by measuring recombination frequencies determined in two ways; direct selection and single colony analysis which requires to pick about 1,000 individual colonies and transfer to selective media. The two analytical methods gave the same result, 2 to 3% frequency of recombination which is about 100-fold higher than that determined by replica plating method. The relatively simple method of direct selection, therefore, may be used conveniently for the selection of recombinants and the determination of recombination efficiency.
고초균 영양 요구주 간의 protoplast 융합으로 형성되는 유전적 재조합주를 재생 배지상 에서 직접 선별하고, 또한 그 수율을 높이기 위하여 여러가지 시도가 행하여졌다. 이 연구에는 3 가지 유형의 이중 영양 요구성 균주들이 사용되었다.
기존의 protoplast 재생배지 성분중 gelatin 이나 albumin 등은 hard agar 나 PVP 등으로 대치 가능하나, casein hydrolysate 만은 다른 질소원으로 완전 대치할수 없는 필수 불가결한 물질임을 알수 있었다. 한편 PVP 가 첨가된 새로운 buffer 의 사용, 고장액 배지에서의 세포의 사전 배양, 그리고 세포를 중층법으로 plating 시킴으로써 protoplast 의 세포벽 재생률을 크게 높일수 있었다.
결국 선택적 buffer 와 선택적 재생배지를 사용하여, 융합에 의하여 형성되는 유전적 재조합주를 재생배지상 에서 직접 선별할수 있게 되었다. 이러한 직접 선별방법 으로, 종래의 제군락 복사에 의한 간접 선별 방법에 비하여 100배 이상 높은 재조합 빈도가 얻어질수 있었는데, 이 값은 단일군락 임의 분석에 의한 간접 선별방법에 의하여 측정된 값과 잘 일치하며, 또한 전자 현미경 이나 prophage 상보 기작으로 확인된 물리적 융합 빈도에도 근접하는 값이다.
그런데, 종래의 제군락 복사방법에 의한 재조합률 측정에 있어서는, 비선택적 밀집 환경에서의 경쟁압과 융합된 염색체 간의 조기 분리 현상으로 유전적 재조합주의 발생과 발현이 낮아지기 때문에, 다른 선별 방법에 비하여 재조합주가 낮은 빈도로 측정되는 것으로 보인다.
