As part of our endearvor to improve an amino-acid producing strain, transformation conditions of plasmid RSF1010 to $\underline{Brevibacterium} $$\underline{lactofermentum}$ were first studied since plasmid RSF1010 isolated from $\underline{E.}$ $\underline{coli} was expressed in $\underline{Corinebacterium}$ sp. and $\underline{Brevibacterium}$ sp. has been widely used in amino-acid over-production.
We tried two different methods to transformation: Y.K method, which includs the various salt treatment, and PEG induced protoplast transformation (PIPT), which includes the protoplasting and PEG treatment and regeneration of transformed protoplast.
Among the conditions of YK method tested, stage of cell culture temperature and time of heat shock, and time of expression have significant effects on plasmid transformation efficiency. Under the optimized conditions, maximum transformation efficiency, 2.36×$10^2$ transformants ug:DNA or 1.03×$10^{-7}$ transformants/cell could be obtained. The time necessary for the expression of streptomycin resistance in an antibiotic free medium was found to be 6 hr. The transformants were selection MMYE medium plate containing streptomycin (50ug/ml).
Secondly, the PIPT method, which is very different to Y.K. method, was used to transform the plasmid RSF1010 into $\underline{Brevibacterium}$ $\underline{lactofermentum}$. Among the conditions tested, protoplasting was very difficult step. But good protoplasting was obtained by glycine-penicilline G-lysozyme treatment. The regeneration frequency was 3.0% on RNB plate. The transformation efficiency $4.05\times^3$ transformantsug:DNA or 1.8×$10^{-2}$ transformants/cell could be obtained. The transformed regenerants were selected on RNB plate containing 100ug/ml streptomycin.
본 연구의 목적은 $\underline{Brevibacterium}$ $\underline{lactofermentum}$에 있어서 유전자 조작을 위한 기초실험으로서 꼬부라진 형태의 균종들 에서 발현 한다고 알려진 plasmid RSF 1010 을 $\underline{Brevibacterium}$ $\underline{lactofermentum}$으로 transformation시키는 방법의 개발에 있다.
우리는 두가지 방법으로 plasmid RSF 1010 을 사용해서 $\underline{Brevibacterium}$ $\underline{lactofermentum}$을 형질전환 시켰다.
첫번째 방법은 Y. K. 방법으로 여러가지 염을 처리해 이 세균이 적정 수용상태를 갖도록 유발시키는 방법이다. 이때의 최적 조건은 초기 지수성장 상태의 세포를 0.1 M $CaCl_2$ 로 처리해 2㎍/ml이상의 plasmid 를 섞어 42℃ 에서 90초 동안 열 충격을 주고 6 시간 정도 발현 시간을 준후 선택 배지에서 키우면 형질 전환된 균이 선택적으로 나타남을 알았다. 이때의 효율은 1㎍ DNA 당 236 마리와 1.03 × $10^7$ 마리당 한 마리 였다.
두번째 방법은 PIP 형질전환 방법으로 형질 전환에 방해가 되는 세포벽을 세포벽 용해 효소인 lysozyme 으로 녹여내고 PEG 를 처리해 plasmid 가 원형질체 내로 투입되는 것을 도와주고 다시 세포벽을 재생 시키는 방법이다. 그러나 $\underline{Brevibacterium}$ $\underline{lactofermentum}$ 의 세포벽은 lysozyme 에 저항성이 커서 penicillin G 와 glycin 으로 lysozyme 의 활동을 도와 원형질체의 형성을 향상 시켰다. 이때의 효율은 1㎍ DNA 당 4,050 마리와 180 마리당 1마리 였다.
