$\underline{Lactobacillus.} \underline{casei}$ ATCC 7469 was successfully converted to protoplast by treating with endo-N-acetyl muramidase(4ug/ml) in 0.9M sucrose phosphate buffer. For full hydwlysis of cell wall, not only treatment of this enzyme but high concentration of sucrose and cold shock were necessary. 5mM of $MgCl_2$ has enhanced the stability of protoplasting cell. Under these conditions, the obtained protoplasts were taken a photography.
The cell wall regeneration of protoplast was more effective on gelatin induced regeneration media than soft overlay method. The concentration of gelatin was optimal at 2.5%. The frequence of regeneration was 6% with treating of the enzyme (4ug/ml) for 20min.
To get genetic marker for detection of fusiont, the mutagenesis with UV irradiation and NTG treatment was carried out. And the streptomycin resistant(400ug/ml) and rifampicin resistant(10ug/ml) mutants were isolated and maintained the stability for several transfer.
In use of these marker, protoplast fusion could be carried out. PEG(polyethyleneglycol) used as a fusogen. Molecular weight of PEG was optimal at 6,000 and it's concentration was 50%. As a result of this experiment, $10^{-5}$ of frequence of fusion could be obtained and it is higher than frequence of spontaneous mutation.
Lactobacillus. Casei ATCC 7469를 4 glml의 endo-N-acetyl muramidase로 0.9M sucrose 인산 완충 용액에서 protoplasting cell을 만들수 있었다.
이때 세포벽의 용해를 위해서는 이 효소 뿐 아니라 cold shock 가 필요 했으며 고농도의 sucrose 는 등장액으로서 역할 뿐 아니라 세포벽 용해에 있어서 상승작용도 한다는것이 밝혀졌다. 또한 protoplast 를 안정하게 유지하기위해서는 5 mM 의 $MgCl_2$ 가 좋은 효과를 나타냈다. 이런 상황에서 얻어진 protoplast 는 광학 현미경으로 사진을 찍을수 있었다. protoplast 의 세포벽 재생은 Soft Agar Overlay 보다 gelatin 유도 재생배지가 좋은 효과를 나타냈으며 이때 gelatin 의 농도는 2.5% 가 적당하였다. 또한 높은 빈도의 재생율을 얻기 위하여 약간의 세포벽 primer 가 있어야 하므로 4 ug/ml 의 효소 용액에서 20분정도 처리가 높은 빈도의 재생을 얻게 할수 있었다. 이때 얻어진 재생율은 6% 정도였으며 재생 colony 가 모두 나타나는데는 5일 정도가 걸렸다. 융합된 세포를 얻기 위하여 genetic marker 를 개발하였는데 Streptomycin 내성균 (400ug/ml)과 rifampicin 내성균 (10ug/ml) 을 자외선과 NTG 처리로 각각 얻을수 있었다. 이 두 종류의 돌연변이를 PEG 6,000(50%)로 처리하여 융합된 이중내성균을 얻을 수 있었고 이때 fusiont 의 빈도는 $10^{-5}$ 정도로 대조 실험균 보다 월등히 높아 ($10^{-7}$) 실질적인 recombinant 로 생각된다.
