Interactions between some TypeII restriction endonucleases and DNA substrates with nicking alterations within or near the recognition sequence of each enzyme were investigated. DNA substrates with a nick at specific positions could be generated by treating the plasmid DNA with endonucleases at lower temperatures(0-4'C). The plasmid DNA, which has a nick within or near the recognition sequence, served as a poor substrate for the endonuclease recognizing the sequence unless the nick was tightly holded by the enzyme: HincII, SalI and SmaI endonucleases cleaved the plasmid DNA substrates specifically nicked by the related isoschizomer, recognizing the same sequence but cleaving different site each other, with much reduced rate compared to the substrates specifically nicked by itself. AvaI could not cleave the plasmid DNA specifically nicked by SmaI at all at the various recommended conditions. Also, nicking alterations in the just outside of the recognition sequence prevent the normal action of the dimeric endonuclease to a considerable extent. In addition, the conditions stabilizing the native conformation of DNA duplex, i.e., low temperature and high ionic strength, made endonucleases act poorly for their cleavage of DNA duplex. The work reported in this thesis the proposed mechanism of the action of TypeII restriction endonucleases with some evidences, particularly in that a conformational shift of duplex DNA within the symmetric DNA-enzyme complex may be required to accomplish the cleavage reaction.
Type II 제한 효소와 그의 인식 염기 배열내 또는 주변에 하나의 니크(nick) 를 갖는 DNA 기질들 과의 상호작용을 검토하였다. 플라스미드(plasmid) DNA 를 저온 (섭씨 0-4˚) 에서 제한 효소를 처리하면 특정 위치에 니크를 갖는 DNA 기질을 많이 분리할수 있었다. 어떤 제한효소의 인식 염기배열에 니크를 포함하는 플래스미드 DNA 는 그 니크가 제한효소에 의해 강력하게 지탱되지 않는한 좋은 기질이 되지 못함을 관찰하였다. 즉, Hinc II, Sal I 그리고 Sma I 제한 효소는, 서로 동일한 염기배열을 인식 하지만 끊는 부위가 다른 동족 제한효소 (iso-Schizomer) 에 의해 특정 위치에 니크를 갖게된 플래스미드 DNA 기질을, 자신에 의해 니크를 갖게된 플래스미드 DNA 와 비교해 볼때, 훨씬 늦은 속도로 끊었다. 또 Ava I 제한 효소는 Sma I 제한효소에 의해 니크를 갖게된 플래스미드 DNA 를 여러 보정된 조건하에서도 전혀 끊지 못하였다. 그리고, 어떤 제한효소의 인식 염기배열 바로 외곽에 존재하는 니크는 제한효소의 정상적인 작용을 상당 정도 저해하는 것을 관찰할수 있었다.
또한 DNA 이중 나선 구조를 안정화 시키는 조건에서는 제한효소가 DNA 의 두 나선을 끊는 작용이 매우 원활하지 못하다는 것도 관찰 할수 있었다. 이러한 실험결과 들은, 대칭적인 제한효소 - DNA 의 결합물 내의 DNA 이중 나선의 구조적인 변화가 type II 제한효소가 DNA 선을 끊는 반응에 필요하다는 작용기작의 모델을 뒷받침하고 있다.
