Mathematical analysis method of recombinant plasmid instability was devised and applied to practical quatitization of the factors involved in plasmid instability.
As a model system, E. coli trp opron recombinant strain MV12/pVH5 (Table 1) was chosen and host repression system was partially derepressed by various concentration of indoleacrylic acid. The result from kinetic test of plasmid instability showed that the stability of pVH5 and the growth rate of MV12/pVH5 were rapidly decreased at above 10 ug/ml of indoleacrylic acid but decreased no more over 40 ug/ml. These suggested that host cell produced trp- variants from MV12/pVH5 at different frequency depending on physiological condition and has some mechanism on the plasmid modification.
In parallel, MV12trpR/pVH5 strain was constructed by conjugation of MV12/pVH5 and CSH61 and the stability of pVH5 was assayed also.
The stability of pVH5 in MV12trpR mutant was greatly decreased compared to that by the effect of indoleacrylic acid but the result of plasmid loss kinetics test was consistent with above description.
The cleared lysates prepared from $trp^-$ variants mostly had modified plasmids of increased sizes, indicating plasmid modification was the main mechanism of plasmid instability.
As the gene source of trp operon, transducing phage $Φ80h^-$ pttrp190 or recombinant plasmid pVH5 and as a cloning vehicle pBR322 were used and both were partially digested with restriction enzyme EcoRI and covalently linked with T4 ligase. The ligation mixture was transformed into E. coli $JA221r_K^-m_K^+$ recAΔtrpE5 and MV12(C600 $r_K^-m_K^+$ recAΔtrpE5), then recombinants were isolated on VB minimal plate containing ampicillin 50 ug/ml and tetracyclin 10 ug/ml.
Interestingly, among the recombinants of JA221/pBR322-trp, one harbored an additional pVH5 plasmid simultaneously, and the stability of pBR322-trp in this strain was somewhat lower than that in the JA221 harboring pBR322-trp only.
재조합 플래스미드 불안정성에 대한 수학적 분석방법을 고안해서 플래스미드 불안정성에 영향을 주는 여러 요인들의 실질적인 정량분석에 응용하였다.
대장균의 트립토판 오페론 재조합 플래스미드를 함유하고 있는 MV12/pVH5 를 선택하여 숙주의 트립토판 오페론 발현에 대한 억제 조절기구를 여러 농도의 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)에 의해 부분적으로 제거하였다. 이때 플래스미드 pVH5 의 안정성과 MV12/pVH5 균주의 성장속도는 인돌아크릴산 10 ug/ml 이상에서 급격히 감소하지만 40 ug/ml 이상의 농도에서는 더 이상의 감소가 일어나지 않는 것이 관찰되었다. 이는 숙주세포가 생리적 조건에 따라서 서로다른 빈도로 MV12/pVH5 로 부터 $trp^-$ 변이주를 발생시킨다는 것과 플래스미드 변형에 대한 어떤 기작을 가지고 있다는 것을 시사한다.
아울러 MV12trpR/pVH5 균주를 MV12/pVH5 와 $CSH61trpR^-$와의 접합에 의해 개발하여 pVH5의 안정성을 분석하였다. 트립토판 오페론의 발현 억제기구가 불활성화된 $MV12trpR^-$ 에서 pVH5의 안정성을 크게 감소하였으나 플래스미드 상실속도로 부터 추리되는 결과는 위의 서술과 일치 하였다. $trp^-$ 변이주의 cleared lysate를 분석한 결과 대부분 분자량이 증가된 변형 플래스미드를 함유하고 있었으며 이는 플래스미드 변형이 플래스미드 불안정성에 관여하는 주요 기작임을 시사한다.
트랍토판 오페론의 유전자원으로서 형질도입 파아지인 $80h^-$ pttrp190 또는 pVH5를, cloning vehicle로서 pBR322를 사용하여, 유전자원과 cloning vehicle을 제한효소 EcoRI으로 부분적으로 끊어서 T4ligase 로서 연결시켰다. 이 반응물을 대장균 JA221 $r_k^-m_k^+$ recA trpE5 와 MV12 (C600 $r_k^- m_k^+$recA trpE5) 의 형질변환에 사용하여 재조합 균주를 엠피실린(ampicillin ) 50 ug/ml, 테트라사이클린(tetracyclin) 10 ug/ml을 포함하고 있는 Vogel Bonner 평판최소 배지에서 분리 배양하였다. 여기서 흥미로운 것은 대장균 JA221/pBR322-trp 재조합 균주들 가운데는 pVH5 플래스미드도 동시에 함유하고 있는 균주가 존재했으며 이 균주에서 pBR322-trp 재조합 플래스미드의 안정성은 pBR322-trp 재조합 플래스미드만을 가지고 있는 JA221 균주에서 보다 다소 떨어지는 것으로 나타났다.
