Determining molecular structures of short-lived species involved in a protein transition is important to answer the most fundamental questions for protein: what does a protein look like, what does it do, how does it do it, and why does it do it? So far, structural dynamics of proteins have been investigated mainly by time-resolved optical spectroscopic techniques because of their superb temporal resolution. Although the optical spectroscopic techniques have been quite successful in identifying the time scales for the formation of inter-mediates involved in protein transitions, their signals have no direct relationship with three-dimensional mo-lecular structure of the protein. Alternatively, time-resolved X-ray crystallography can provide high spatio-temporal resolution, but it requires highly-ordered and radiation-resistant single crystals, limiting its applica-bility to only a few model systems. Moreover, the protein motions in crystalline sample might be different from those in physiological aqueous environment where proteins actually perform their functions.
In this regards, time-resolved X-ray solution scattering is a perfect technique to circumvent these limi-tations of time-resolved optical spectroscopy and time-resolved X-ray crystallography. Over the last decade, time-resolved X-ray solution scattering based on the 3rd-generation X-ray source has revealed structural dy-namics of various reactions of small molecules and proteins in solution in real time. For example, we compre-hensively elucidated the multistep structural dynamics of wild-type sperm whale myoglobin after CO photolysis using time-resolved X-ray solution scattering and sub-100-ps structural dynamics of wild-type horse heart myoglobin after CO photolysis was probed by applying the time-slicing scheme. Furthermore, we investigated the allosteric pathways of homodimeric hemoglobin from the clam Scapharca inaequivalvis and unprecedented structural details of reaction intermediates along the pathways such as changes in the heme？heme distance, the quaternary rotation angle of subunits, and the number of water molecules at the subunit interface. Various alternative approaches to widen the applicability of time-resolved X-ray solution scattering as well as developments of the next-generation X-ray and electron sources will make it possible to unambiguously answer the questions above in the near future.
많은 단백질들이 실제 고유의 생물학적 기능을 수행하는 용액상에서의 단백질 구조 동역학 연구는 단백질의 구조, 기능, 동역학 사이의 근본적인 상관관계를 이해하는데 있어 매우 중요하다. 엑스선은 용액내 모든 원자들로부터 산란 및 회절하여 용액내 용질 분자의 구조변화 뿐만 아니라 주변 용매 분자와의 상호작용에 대한 정보를 제공하므로 용액상 시간분해 엑스선 산란법은 용액상 단백질의 구조 동역학을 연구하는데 있어 매우 적합하다. 본 논문에서는 용액상 시간분해 엑스선 산란법을 이용한 헴 단백질들의 구조 동역학 연구에 대해 기술하였다.
2장에서는 용액상 시간분해 엑스선 산란법을 이용하여 용액상 마이오글로빈의 구조동역학을 연구하였다. 우선 2.1장에서는 야생형 향유고래 마이오글로빈 (wild-type sperm whale myoglobin)의 용액상 광반응 경로를 규명하였다. CO 리간드 광분해 후 100 피코초부터 10 밀리초까지의 측정 시간 영역 상에서 구조가 서로 다른 4개의 반응 중간체 (B, C, D, and S)가 존재함을 확인하였다. 특히 측정 시간 영역 상에서 가장 먼저 관찰되는 반응 중간체 (B)는 헴 주변에 위치하는 말단 히스티딘 (distal histidine)과 광분해된 CO 리간드 사이의 서로 다른 상호작용으로 인해 구조적 하위상태 (conformational substates)를 가지게 되어서 두번째 반응 중간체 (C)로 전이함에 있어서 병렬 반응 경로 (biphasic transition)를 가짐을 밝혔다. 2.2 장에서는 타임 슬라이싱 기법 (time-slicing scheme)을 사용하여 일반적인3세대 방사광 가속기 (synchrotron)가 제공하는 시간분해능 (~100 피코초)보다 이른 시간 영역에서 일어나는 야생형 말 마이오글로빈 (wild-type horse heart myoglobin)의 용액상 구조 동역학을 연구하여 추후 4세대 방사광 가속기 (XFEL)를 이용한 후속 연구에 대한 초석을 마련하였다.
3장에서는 용액상 시간분해 엑스선 산란법을 이용하여 야생형 헤모글로빈 동종이합체 (wild-type homodimeric hemoglobin from clam Scapharca inaequivalvis) 및 돌연변이 (Phe97→Tyr)의 용액상 광반응 경로 및 반응 중간체들의 용액상 구조를 규명하였다. CO 리간드 광분해 후 100 피코초부터 56.2 밀리초까지의 측정 시간 영역 상에서 야생형 및 돌연변이 모두 구조가 서로 다른 3개의 반응 중간체 (I1, I2, and I3)를 가짐을 확인하였고 하나의 공통된 광반응 경로를 서로 공유함을 규명하였다. 다만 돌연변이의 경우는 돌연변이 효과로 인해 전반적인 광반응이 가속됨을 확인할 수 있었다. 또한 CO 리간드가 1개만 광분해 (partially photolyzed form) 되거나 2개 모두 광분해 (fully photolyzed form)되는 경우에 상관없이 각 반응 중간체의 구조가 동일함을 확인함으로써 CO 리간드가 1개만 광분해 되더라도 CO 리간드가 2개 모두 광분해 된 경우와 동일한 구조 변화를 유도한다는 사실을 직접적으로 규명하였다. 뿐만 아니라 헴 간 거리 변화, 서브유닛 간 회전 각도 변화, 서브유닛 사이의 물분자 출입 등과 같은 매우 자세한 용액상 단백질의 구조 변화를 규명하였고 돌연변이 효과로 인한 구조 변화 차이 또한 확인하였다.
4장에서는 용액상 시간분해 엑스선 산란법의 적용범위 확대 및 한계 보완을 위한 접근법들을 제안하였고 일부 선행 연구하였다. 4.1장에서는 광반응 개시 후 측정 시간을 변화시키며 데이터를 수집하는 것은 물론 온도, 압력, pH 등 또한 변수로 사용하는 용액상 다중변수분해 엑스선 산란법 (multivariable-resolved X-ray solution scattering)을 통한 연구법을 제안하였다. 선행 연구에서는 시간 및 온도를 변수로 사용하는 다중변수분해 엑스선 산란법을 이용하여 야생형 헤모글로빈 동종이합체의 용액상 광반응 경로상 활성화 자유 에너지, 활성화 엔탈피, 활성화 엔트로피를 규명하였다. 이와 더불어 용액상 광반응 과정 중에 발생하는 용질 분자와 용매 분자 사이의 열교환 과정을 용매 신호 변화를 통해 추적함으로써 간접적으로 용질 분자의 반응 경로를 규명하는 연구법을 제안하였다. 선행 연구에서는 p-hydroxyphenacyl diethylphosphate (HPDP)의 용액상 광반응 경로를 규명하였고 기존 시간분해 분광학 연구 결과와 잘 일치함을 확인하였다. 또한 기존 시간분해 분광학 연구에서는 밝히지 못한 용질 분자와 용매 분자 사이의 열교환 과정도 함께 규명하였다. 앞으로 용매 신호 대비 용질 신호의 신호대잡음비가 충분하지 못해서 현재까지는 연구가 어려웠던, 무거운 원자를 포함하지 않는 다양한 분자 시스템들에 대해 용액상 시간분해 엑스선 산란법을 이용한 용액상 반응 동역학 연구를 진행할 것이다. 4.2장에서는 용액상 또는 결정상 구조 동역학 연구에 특화된 시간분해 엑스선 산란법을 보완할 수 있는 연구법으로 기체상, 표면상, 또는 박막상 구조 동역학 연구에 특화된 시간분해 전자 회절법을 제안하였다.
