Photon energy absorbed by chemicals in cells activating photochemical effects is useful in photomedicine. Numerous light based techniques for biomedical applications including photodynamic therapy (PDT) or photochemical tissue bonding (PTB) are growing due to its effective therapeutic performances and less side effects in clinic. However, delivery of the sufficient light energy to the target lesion has been limited to the superficial layer of the tissue since intrinsic absorption and scattering results exponential decay of light intensity through the depth. Here, we demonstrate bioluminescence resonance energy transfer (BRET) based photochemical activation irreverent to the limitation of optical penetration depth. Two mutants of Renilla luciferases (RLuc8 and RLuc8.6), were used as bioluminescence molecules to activate chlorin e6 (Ce6) and Rose Bengal (RB), photosensitizers that generate reactive oxygen species in high yield. To activate Ce6 (absorption peak at 660 nm) accumulated in cancer cells, RLuc8 (emission peak at 488 nm) was conjugated with quantum dots (QDs, emission peak at 665 nm) to maximize spectral bandwidth overlaps between light sources and photosensitizers. Alternatively, both
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RLuc8.6 (emission peak at 535 nm) and RB (absorption peak at 550 nm) were bound on the surface of bovine serum albumin (BSA) via biocompatible copper free click reaction of DBCO and azide functional groups. Signals of ROS were detected upon the addition of coelenterazine, substrates of luciferase, into the solution containing BRET molecules. BRET based photodynamic therapy in a colon adenocarcinoma cell line (CT26) evaluated by MTT cell proliferation assay kit showed considerable cytotoxicities. Our results show that the promising potential of BRET based ROS generation as a novel technique to overcome the penetration depth limitations of conventional PDT for deep tissue tumor or metastatic cancer. Also, bioluminescence energy induced remote ROS generation may be applied to other photomedicine techniques including photochemical tissue bonding (PTB).
광화학반응을 이용한 암세포 치료기술은 탁월한 치료능력과 약물치료에 비해 현저히 감소된 부작용으로 인해 임상의학에서 각광받고 있는 광의학 기술이다. 하지만 광의학 기술의 특성상 빛을 이용한 광감응 시료의 활성화가 필요한데, 빛 에너지가 생체조직을 지나는 동안 급격하게 감소되는 현상으로 인해 피부 표면이나 내시경이 접근 가능한 국소부위에서만 제한적으로 광의학 기술이 적용되어왔다. 이에 본 연구는 생체 내부에서 발생되는 광원을 이용하여 광감응 시료를 활성화시는 방법에 대해 연구하였으며, 이를 통한 암세포의 치료를 시행하였다. 488 nm의 빛을 발생하는 생체발광 분자인 Rluc8루시퍼레이즈를 Renilla 의 유전자로 부터 배양하여 얻었고, 이를 655 nm의 빛을 발생시키는 양자점과 결합하여 광감응제가 흡수하는 파장인 660 nm 에 가까운 빛을 생체 내부에서 발생시켰다. 또한 내부 광원은 비침습적으로 생체 내부에 들어가야할 뿐만 아니라 생체적합해야하며, 분해 및 배출에 용이하여야하기에 양자점을 사용하지 않도록 루시퍼레이즈와 광감응제를 직접적으로 결합하는 연구 또한 진행하였다. 535 nm의 빛을 발광하는 루시퍼레이즈의 변종인 RLuc8.6 를 배양한 후 이를 565 nm의 빛에 반응하는 광감응제인 로즈벵갈과 결합함으로써, 생체발광 에너지가 생체발광 공명 에너지 전달 현상을 통해 직접적으로 광감응제를 활성화 시킬 수 있도록 하였다. 두 가지 방법으로
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활성화된 광감응제는 세포내 독성을 보여주었고, 세포내 활성산소를 발견함으로써 광화학반응에 의해 세포독성이 유도되었음을 증명할 수 있었다. 본 연구는 기존에 연구된 광의학기술의 가장 큰 한계라고 할 수 있는 광에너지 침투 깊이에 관한 문제를 근본적으로 해결할 수 있는 방법을 제시하였다. 또한 광역동 치료 기술 뿐만 아니라 광화학 조직 결합 기술 (Photochemical tissue bonding)과 같이 활성산소의 발생을 이용하는 다른 광의학 기술에도 널리 적용될 가능성이 있다. 을 거치지 않고, 최소침습으로 치료할 수 있는 임상에 적용이 가능한 치료법을 선보였다. 따라서 이러한 연구 결과는 신체 내부로 빛을 전달하기 어려웠던 광유전학 등의 연구에도 폭 넓게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
