Delivering macromolecules, such as siRNA, antibodies, peptides, and etc., into cells is a considerable challenge in biological and medical research. However, cell membranes, one of the most common biological barriers, strongly limit the transport of exogenous materials into the cytoplasm and nucleus. To successfully achieve a desired outcome, vector-based and physical methods are conventionally used. Nonetheless, since these methods rely on exogenous material, high energy particle, or energy field, it can show toxicity or off-target effects. To overcome such downsides, novel delivery routes, such as reverse transfection, have been developed.
The term reverse transfection, or surface-mediated delivery, differs from other delivery methods in that cells are seeded on top of particles that have been previously immobilized onto a surface, rather than adding particles to previously seeded cells. The potential impact of using DNA release from the substrate shows huge potential from basic biomedical research to gene-based therapies. However, , although the interaction between the cell and cell-culturing substrate takes an important part of reverse transfection, there had only been limited studies on the effect of substrate in cellular uptake process.
Here, we studied how micro- and nanotopography enhances the cellular uptake process and lead to a higher efficiency of reverse transfection. In the first part of the thesis, we discussed about nano-villi platform that mechanically stimulates the cells via topographical effects. On nano-scale post structures with various diameter and pith, GFP siRNA was loaded and GFP expressing HeLa cells were then seeded. It was found out that the transfection efficiency was significantly increased when nano-scale structures existed on the surface.
The second part of this thesis deals with wrinkled surface mediated reverse transfection platform, combined with microwell structures. Although nanotopography exhibits diverse effects on cell’s natural activity, this may not be desirable on certain situations or experimental setups. Therefore we have designed a wrinkled platform that maximizes the surface area via microscale random structures, which leads to increased cell-substrate contact area. Similar to the nano-villi platform, siRNA was successfully immobilized on the surface and the rate of intraceullular delivery was tested by blocking the GFP expressing gene of GFP expressing HeLa cells. The transfection efficiency was higher on wrinkled surfaces, compared to flat surface without any structures. Our wrinkled surface platform was then combined on microwell structure, in order to achieve multiplex, addressable delivery.
Our nano-villi and wrinkle mediated reverse transfection platform demonstrates a novel application and the importance of topography-mediated siRNA delivery to the cells as an effective method for genetic manipulation.
형질 전환 (Transfection)은 세포 내부로 유전 물질을 전달해 유전자 발현을 조절함으로써 세포가 원하는 형질을 띄도록 하는 기술로, 특별한 특징을 지니는 세포를 제작하여 사용하거나, 유전자의 기능을 밝히는 등 생물학 실험에 보편적으로 사용되는 기술 중의 하나이다. 또한 최근에는 파킨슨 병 (Parkinson’s disease)이나 심혈관계 질환 (Cardiovascular disease) 과 같은 질병의 치료 목적으로도 사용될 수 있는 가능성을 보여주고 있는 중요한 기술로써 자리매김하고 있다. 세포를 효과적으로 형질 전환 하는 데에 있어 가장 큰 장애물로써 작용하는 것이 세포의 막 (cellular membrane) 구조이다. 세포 외곽을 감싸는 막부터 각 소기관의 막 구조까지, 세포 내부로 외부의 물질이 자유롭게 출입하는 것을 방해하는 역할을 하고 있기 때문에 유전 물질을 투입하는 것을 저해하는 효과를 나타낸다. 이를 극복하고자 전달체 (vector)를 사용한 방법이나 물리적인 방법들이 개발되고 사용되어 왔으나 모두 세포에 독성을 나타내거나 기타 부작용들이 있어 새로운 전달 방법의 개발이 필요하다.
표면 중개 유전자 전달 (reverse transfection)은 기존의 방법과는 다르게 세포를 기르기에 앞서 표면에 전달하고자 하는 유전 물질을 고정시켜 놓은 뒤 세포 배양을 시작하는 전달 방법이다. 이러한 방법은 세포와 유전 물질 간의 접촉 확률을 높여주고 더욱 장기간의 처리가 가능하다는 점에서 큰 잠재력을 보이는 기술이다. 하지만 기술의 특성상 세포와 표면 간의 상호 작용이 중요한 부분을 차지함에도 불구하고 그에 관한 연구들이 부족한 실정이다.
이에 우리는 표면 미세 구조가 세포 내부로 물질을 전달하는 데에 어떤 역할을 하는 지에 대해 분석하고, 이를 바탕으로 고효율 표면 중개 유전자 전달 플랫폼을 개발하였다. 논문의 첫 부분에서는 나노 융모 구조 (nano-villi structure) 가 세포를 자극함으로써 물질 전달의 효율을 높이는 현상에 관한 연구에 대해 서술하였다. 다양한 크기와 배치 간격을 가지는 나노 융모 구조가 있는 표면에 GFP의 발현을 억제하는 siRNA를 도포한 뒤, GFP를 발현하는 HeLa 세포를 배양함으로써 유전자 전달 효율을 측정할 수 있었다. 다양한 실험을 통해 나노 구조가 있을 경우 유전 물질의 전달 효율이 증가한다는 사실을 확인 할 수 있었다.
다음으로는 마이크로 스케일의 주름 구조를 가지는 표면에서의 물질 전달 효율에 대한 연구에 대해 서술하였다. 나노 구조를 가지는 표면이 물질 전달은 물론 다양한 세포 활동에 복합적인 영향을 미치지만, 이러한 영향은 실험의 목적이나 상황에 따라 부정적인 영향을 미칠 수도 있다. 이에 세포와 표면 사이의 접촉 면적은 최대화 하되 세포의 활동에 영향을 미치지 않는 마이크로 스케일의 구조를 제작해 표면 중개 유전자 전달의 효율에 대해 알아보았다. 앞서서 진행했던 나노 구조의 실험과 유사하게 GFP를 발현하는 세포의 GFP 발현을 억제시켜 효율을 측정해본 결과 마이크로 구조가 있는 표면에서 전달 효율이 증가하는 사실을 확인 할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 마이크로 웰 어레이 (microwell array)에 주름 구조를 도입하여 실험을 진행해본 결과 동시에 다수의 실험을 진행할 수 있는 효과적인 플랫폼으로서의 가능성을 확인 할 수 있었다.
미세구조를 기반으로 한 우리의 표면 중개 유전자 전달 플랫폼은 세포 내부로 물질을 전달함에 있어 표면 구조의 중요성을 밝혀 냈을 뿐만 아니라 유전자 조작 실험에 있어 유용한 고효율, 스루풋 플랫폼으로서 가능성을 보여주고 있다.
