Quality of recombinant therapeutic proteins, such as mAb and Fc-fusion protein, has effects on biological activities, in vivo half-life, solubility, and so on. Due to the importance of quality, Chinese hamster ovary (CHO) cells are predominant host cell lines for therapeutic proteins because they can produce recombinant proteins having a similar quality with those of human. Recombinant protein quality, expressed in CHO-based production system, can be determined at the oxidative stress, cell lines, culture modes and key parameters of cultivation. In this study, we investigate what enhance the quality in CHO cell culture. Understanding poten-tial steps and effectors in each step causing varieties of product quality will improve our abilities to control critical product quality in the CHO cell based production system.
To determine the involvement of reactive oxygen species (ROS) on the production and quality of TNFR-Fc in recombinant Chinese hamster ovary (CHO) cells, CHO cells were cultivated in serum-free media with various ROS scavengers containing proline, copper sulfate and dimethyl sulfoxide (DMSO) and special envi-ronment such as low temperature and high osmolality. Accumulation of ROS is coupled with an increase in oxidative stress and cause oxidative damage to biomolecules. Hyper-oxidized proteins such as TNFR-Fc may lead to improper folding of protein and aggregation if oxidative stress was not properly controlled. Intracellu-lar ROS were quantified with 2,7-dichlorofluorescein (DCF). The chemical additives of proline, copper sulfate, and DMSO used as ROS scavengers increased the production titer and specific productivity, but did not enhance significantly the quality of TNFR-Fc such as TNF receptor binding activity and aggregation. By lo-wering the temperature from 37℃ to 34℃ and high osmolality of 400 mOsm/kg, the production and quality of TNFR-Fc significantly improved. However, the result indicated that cell growth and production of TNFR-Fc by ROS scavengers such as proline, copper sulfate and DMSO and environment culture conditions oc-curred independently from ROS levels.
The sialic acid is a terminal sugar and the only charged oligosaccharide present on glycoprotein oligosac-charides. The absence of sialic acid on glycoprotein oligosaccharides results in rapid in vivo clearance by the asialoglycoprotein receptor. Glucocorticoids (GC) are a class of steroid hormones characterized by an ability to bind to the glucocorticoid receptor (GR) and elicit effects such as regulation of glucose, protein, and fat metabolism as well as anti-inflammatory and immunosuppressive. GC have been reported to induce gene expression of a2,6-sialytransferase (ST), but not a2,3-ST. In this study, we investigated the effects of dexamethasone (DEX) on the CHO cell glycosylation process. We demonstrated that DEX was indeed capable of increasing the sialylation of TNFR-Fc fusion protein produced by CHO. To investigate the effect of dexamethasone on the activity and pI isoforms of TNFR-Fc, the culture supernatant was harvested by centrifugation and filtration through 0.2 uM membrane. Dexamethasone shows slightly higher TNF-α binding activity (6% in 0.1 uM dexamethasone) compared to untreated control and acidic pI isoforms below pI 4.5 was observed in dexamethasone supplemented culture compared to control by gel IEF. N-linked oligosaccharide chromatographs for cultures with 0.1-10 uM DEX treatment showed generally enhanced monosialylated fractions. DEX concentrations from 0.01 to 10 uM resulted in 6.8% to 10.0% increase in the sialic acid fractions in the oligosaccharide distributions for the DEX supplemented cultures. The sialic acid content of TNFR-Fc in the absence of additives was 24 mol sialic acid/mol protein, while it increased to 27 mol sialic acid/mol protein in the presence of 0.1 uM dexamethasone.
Because of its large size and structural complexity, preparations of the cysteine-rich tumor necros is factor receptor-Fc (TNFR-Fc) that are produced using recombinant CHO cells contain many undesirable impurities. In this study, to purify TNFR-Fc, cell culture supernatant was first clarified using a pre-filter and sterilization filter and then subjected to a series of purification steps consisting of protein A affinity column chromatography, anion exchange chromatography, and hydrophobic interaction chromatography (HIC).To characterize the presence of TNFR-Fc-related impurities after the HIC step, the HIC eluates were further fractionated using analytical HIC and then separated by size exclusion chromatography (SEC). Several product-related impurities were detected during SEC, including low molecular weight (LMW) species, high molecular weight aggregates, and species with a size equivalent to authentic TNFR-Fc. N-terminal sequence analysis of the LMW species indicated that N-terminal amino acids had been partially deleted from the protein sequence at amino acid positions 1-185 or 1-223. Peptide mapping analysis followed by quadrupole time-of-flight mass spectrometry (Q-TOF-MS) and MS/MS indicated that the species that was equivalent in size to authentic TNFR-Fc contained scrambled disulfide bonds linked as Cys98-Cys115 or Cys104-Cys112. These product-related impurities, which led to a marked reduction in TNF- α neutralizing activity during cytotoxicity neutralization assays in L929 cells, should be removed from the final product during purification.
항체 및 융합단백질과 같은 치료용 재조합 단백질에서 품질은 생물학적 활성, 체내 반감기, 용해도 등에 영향을 미친다. 이와 같은 품질의 중요성 때문에 인간의 체내 존재하는 단백질과 가장 유사한 품질의 재조합 단백질을 생산할 수 있는 CHO 세포가 치료용 단백질 생산에 숙주세포로 널리 사용되고 있다. CHO 기반 생산 시스템에서 생산된 재조합 단백질의 품질은 산화적 스트레스, 세포주, 배양방법 및 주요 공정인자에 의해 결정된다. 본 연구에서는 CHO 세포 배양에서 품질을 향상시키는 방법들을 밝히고자 하였다. 이러한 품질 차이를 유발하는 단계 및 잠재적인 인자에 대한 이해는 CHO 세포 기반 생산 시스템에서 주요 품질을 조절할 수 있는 능력을 향상하는데 도움이 될 것이다.
재조합 CHO 세포주에서 TNFR-Fc의 생산과 품질에 활성산소가 관련되어 있음을 밝히기 위하여, CHO 세포를 프롤린, 황산구리, DMSO와 같은 활성산소 스캐빈저를 넣은 무혈청배지 및 낮은 배양온도, 고삼투압의 특정 환경조건에서 배양하였다. 활성산소의 축적은 산화적 스트레스의 증가와 연관되어 있으며, 이는 생체분자에게 산화적 파괴를 일으킬 수 있다. TNFR-Fc와 같은 매우 높은 수준으로 산화된 단백질들은 산화적 스트레스가 적절하게 조절되지 못하면 부적합한 폴딩 및 응집체들이 발생할 수 있다. 세포내 활성산소는 2,7-dichlorofluorescein (DCF)를 활용하여 정량하였다. 활성산소 스캐빈저로 사용된 프롤린, 황산구리, DMSO와 같은 화학 첨가물들은 TNFR-Fc의 생산량 및 세포 생산성을 증가시켰지만, TNF 수용체 결합 활성 및 단백질 응집체와 같은 품질은 크게 향상시키지 못하였다. 이와는 달리, 37℃ 에서 34℃로 저온배양을 하거나 400 mOsm/kg의 고삼투압 배양조건은 TNFR-Fc의 생산 및 품질을 크게 향상시킬 수 있었다. 결론적으로, 활성산소 스캐빈저로 사용된 프롤린, 황산구리, DMSO및 배양 환경조건들에 의한 세포 성장 및TNFR-Fc의 생산량은 세포내 활성산소량과 직접적으로 상관관계가 없다는 것을 확인하였다.
시알산은 당단백질의 올리고당 당쇄에 존재하는 말단 구성성분으로서 유일하게 전하를 지닌 올리고당이다. 당단백질로부터 시알산이 탈락되면 아사이알로 당단백질 수용체에 결합함으로서 빠르게 생체내에서 제거된다. 글루코코티코이드는 스테로이드 호르몬의 일종으로서 글루코코티코이드 수용체에 결합하여 포도당, 단백질, 지방 대사 조절뿐만 아니라 항염증 및 면역억제 기능을 수행한다. 글루코코티코이드는 α2,6-sialytransferase 및 α2,3-sialytransferase의 유전자 발현을 유도한다고 알려졌다. 본 연구에서는 덱사메타손이 CHO 세포의 당쇄화 과정에 미치는 영향을 조사하였다. 결론적으로, 덱사메타손은 CHO 세포에서 생산되는 TNFR-Fc 융합단백질의 시알산 함량을 증가시켰다. 추가적으로 덱사메타손이 TNFR-Fc의 활성및 pI isoforms에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 원심분리와 0.2 uM 멤브레인 여과를 통해 배양 상등액을 준비하였다. 덱사메타손은 TNF-α 결합 활성을 미비하게 향상시켰으며 (0.1 uM 덱사메타손에서 6%), gel IEG에서 대조군 대비 pI 4.5 이하의 산성의 isoforms들이 분포함을 확인할 수 있었다. 0.1-10 uM 덱사메타손을 처리한 배양액의 N-linked 올리고당 크로마토그램은 대부분 모노시알산 분획이 증가했음을 보여주었으며, TNFR-Fc 올리고당 분포에 있어 시알산 함량을 6.8% 에서 10.0%까지 증가시킬 수 있었다. 따라서, TNFR-Fc의 대조군이 24 mol sialic acid/mol로 분석된 것과 달리, 0.1 uM 덱사메타손에서는 27 mol sialic acid/mol로 증가되었다.
시스테인인이 다량 포함된 TNFR-Fc는 구조적 복잡성과 큰 분자크기로 인해 CHO 세포에서 생산 시 원하지 않는 다량의 불순물들을 포함하게 된다. 본 연구에서는 TNFR-Fc를 정제하기 위하여 배양액을 전처리 및 멸균필터로 여과한 후, protein A 친화크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 단계적으로 수행하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계 이후, TNFR-Fc 유래 불순물을 특성분석하기 위하여 용출액은 추가적으로 분석용 소수성 상호작용 크로마토그래피로 분획하였고, 이후 크기 배제 크로마토그래피를 통해 불순물들을 분리하였다. 크기 배제 크로마토그래피는 authentic TNFR-Fc과 동일한 크기의 분획과 저분자량 및 고분자량 응집체의 제품관련 불순물들을 확인할 수 있었다. 저분자량 불순물은 N-말단 아미노산 서열분석을 통해 1-185 또는 1-223 위치에 일부 절단된 것을 확인하였고, authentic TNFR-Fc와 동일 크기의 분획은 Q-TOF-MS와 MS/MS에 의한 펩타이드멥핑을 통해 Cys98-Cys115 또는 Cys104-Cys112와 같은 scrambled디설파이드본드를 포함하고 있다는 것을 확인하였다. 이러한 제품관련 불순물들은 L929 세포독성 중화시험에서 TNF- α 중화능이 크게 감소하기 때문에, 최종 제품을 제조하기 위해서는 이러한 불순물들을 제거해야 한다.
