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Development of electrochemical diagnostic system based on molecular beacon comprising metal Ion binding aptamer = 금속 결합 압타머 기반의 분자비콘을 이용한 전기화학적 진단 시스템 개발
서명 / 저자 Development of electrochemical diagnostic system based on molecular beacon comprising metal Ion binding aptamer = 금속 결합 압타머 기반의 분자비콘을 이용한 전기화학적 진단 시스템 개발 / Songyi Baek.
저자명 Baek, Songyi ; 백송이
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2015].
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초록정보

Here, we developed a one-step, label-free, modification-free, and signal-on electrochemical diagnostic systems utilizing G-rich aptamer sequence which has specific interaction with Pb2+ as signaling reagent. We have designed molecular beacon probe which consists of target-binding sequence in the loop part and Pb2+-binding aptamer sequence in the stem part. The probe forms intramolecular hairpin-loop structure. In the presence of Pb2+, the Pb2+ binds with aptamer sequence in the stem part. In this state, the bound Pb2+ access to the electrode surface during the preconcentration step of SWASV with relatively lower diffusion rate as compared to that of free Pb2+. When the target biomolecule is applied, the target biomolecule bind to loop part of the beacon probe, and the structure of beacon probe changes from hairpin-loop structure to linear structure, consequently Pb2+ is released from the probe. Accordingly, the current signal of Pb2+ is increased linearly as the amount of target biomolecule increased. In chapter 2, we have designed molecular beacon probe which consists of target DNA complementary sequence in the loop part and Pb2+-binding aptamer sequence in the stem part. First, we investigated signaling mechanism resulting from different diffusion rate of Pb2+, GQ-MB bound Pb2+ by performing chronoamperometric measurements. Then we confirmed viability of the signaling strategy using artificial target DNA. Finally, the strategy was employed to detect C. trachomatis gene derived from an infected patient sample with high sensitivity (LOD = 29.5 fM). Therefore, based on our novel electrochemical strategy, the target DNA can be detected very conveniently without the need for any complicated labeling/modification or secondary procedures. In chapter 3, we developed electrochemical aptasensor for thrombin detection as a model target protein. The strategy of electrochemical aptasensor is analogous to the DNA detection strategy employing GQ-MB described in chapter 2. The GQ-MB for thrombin detection consists of thrombin aptamer sequence in the loop part and Pb2+-stabilized G-quadruplex in the stem part. The current signal of Pb2+ is increased as the amount of target biomolecule increased with a linear calibration range of 10 pM to 100 nM and a detection limit of 2.87 pM with high selectivity over the most abundant proteins in human plasma such as albumin and IgG. Finally, the diagnostic capability and practical application of the aptasensor were demonstrated by its use in thrombin detection in human blood serum, indicating that the present strategy was promising for POCT application in clinic assay and various protein analyses. In chapter 4, the operation of an electrochemical real-time PCR, based GQ-MB to detect target DNA described in chapter 2, has been demonstrated. PCR was performed on a fabricated electrode-patterned chip containing Pb2+ and GQ-MB while recording the anodic current peak by measuring square wave anodic stripping voltammetry (SWASV). The electrochemical real-time monitoring of polymerase chain reaction (PCR) by quantifying initial copy numbers of hemagglutinin gene of pandemic influenza A (H1N1) on an electrode chip showed that the peak current was found to increase with an increase of PCR cycle number. A standard calibration plot of the threshold cycle (Ct) value versus the log initial copy number gives reliable linearity and 104.5 % PCR efficiency that is comparable to that of optical fluorescent-based real-time PCR.

전기화학적 분석 방법은 높은 민감도, 빠르고 간편한 프로세스, 경제성 및 소형화 가능 등의 장점들로 인하여 현장진단 (POCT)을 위한 생체물질 진단 방법 개발에 적합하다. 다양한 전기화학적 분석방법 중 스트리핑 전압전류법은 높은 민감도로 금속 이온을 감지하기에 적합한 측정법이다. 최근, 금속 이온과 특이적으로 결합하는 DNA 압타머와 관련된 연구들이 많이 보고되었으며, 이 중 우리는 납 이온과 구아닌 4겹 (G-quadruplex) 압타머의 상호작용에 초점을 맞추어 진단을 위한 준비과정이 필요 없고 간편한 전기화학적 DNA 진단, 단백질 진단 및 실시간 PCR 모니터링 시스템을 개발하였다. 먼저 챕터 2 에서는 납 이온과 특이적으로 결합하는 압타머가 포함된 분자비콘을 이용하여 원-스텝 전기화학적 DNA 분석법을 개발하였다. 금속 결합 압타머가 포함된 분자비콘은 두 가지 부분으로 구분될 수 있는데, 루프 부분은 타겟 DNA와 상보적인 DNA 서열을 가지고 있으며 줄기 부분은 납 이온과 특이적으로 결합하는 압타머로 구성되어 있다. 따라서 타겟 DNA가 존재할 때는 타겟 DNA가 분자비콘의 루프 부분과 상보적으로 결합하여 납 이온이 자유롭게 전극에 도달할 수 있지만 존재하지 않을 때는 납 이온이 분자비콘의 줄기부분에 결합한 상태로 존재하게 된다. 대시간 전류법 (chronoamperometry)을 이용하여 자유로운 납 이온과 분자비콘-결합 납이온의 확산 속도를 비교하였을 때, 자유로운 납 이온이 분자비콘-결합 납이온과 비교하여 높은 확산 계수를 보였으며 이 원리를 이용하여 DNA를 진단하였다. 성병 유발인자인 C. trachomatis 유전자를 진단하였을 때, 69.5 pM의 높은 검출 한계를 보였으며 다른 DNA에 대한 특이도 또한 확인하였다. 이 방법은 신호물질 표지나 전극 부가 처리와 같은 준비과정이 없이 전체 진단 방법이 한 단계로 구성된 원-스텝 DNA 진단 방법이다. 이 보고는 납 이온을 신호물질로 이용하고 납 이온과 압타머의 결합을 이용하여 생체물질을 진단한 첫번째 보고라는 큰 의미를 가지고 있다. 개발한 분석방법은 높은 민감도와 간편함으로 인하여, 앞으로의 POCT 적용을 위한 휴대용 유전자 진단 시스템 개발을 위한 기반기술로 활용될 수 있을 것이다. 챕터 3에서는 위에서 개발한 금속 결합 압타머가 포함된 분자비콘을 이용하여 단백질 진단에 적용하여 보았다. 모델 단백질로는 혈액응고에 관여하는 트롬빈 (thrombin)을 이용하였다. 사용한 분자비콘은 DNA 진단때 개발한 분자비콘과 매우 유사한 형태로, 줄기 부분은 금속 결합 압타머 서열을 가지고 있으며 루프 부분은 트롬빈과 특이적으로 결합하는 트롬빈 압타머 서열로 이루어져 있다. 이 분자비콘을 이용하여 트롬빈을 2.87 pM 검출한계까지 검출할 수 있었으며, 이 결과는 다른 방식을 통한 트롬빈 진단 방법들과 비교하여 볼 때 높은 민감도와 낮은 검출한계임을 확인하였다. 또한 인간 혈장에서 가장 많은 부분을 차지하는 알부민과 IgG를 분자비콘에 적용하여 높은 특이도를 확인하였다. 마지막으로 실제 인간 혈청을 이용하여 임상 샘플 진단 가능성을 확인하였다. 높은 재현성과 정밀도를 나타내는 결과들을 기반으로, 개발한 단백질 진단법이 임상 진단 적용을 위한 잠재력이 있다는 결론을 내렸다. 마지막으로 챕터 4에서는 앞서 개발한 금속 결합 분자비콘을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응 (PCR) 분석 방법을 개발하였다. 먼저 DNA 용해점 분석 (Tm analysis)를 통하여 금속 결합 압타머의 열안정성을 확인하였으며, 금속 결합 분자비콘에 형광을 표지하여 분자비콘의 PCR 실시간 모니터링 가능성을 확보하였다. 폴리에스터 필름에 탄소와 은 잉크를 이용하여 전극을 패터닝 하였고, 밀폐 접착 챔버를 이용하여 실시간 측정을 위한 PCR 칩을 제작하였다. H1N1 바이러스에서 추출한 hemagglutinin (HA) 유전자를 이용하여 PCR을 진행하였고 스트리핑 전압전류법을 이용하여 세 사이클마다 측정하였다. PCR 사이클 수가 증가할수록 신호가 증가하는 경향을 보였으며, 초기 DNA 농도를 다르게 하여 초기 DNA농도에 따른 임계치 값 (Ct) 결과를 얻었다. 이를 바탕으로 초기 DNA 농도에 따른 임계치 값 그래프를 그려보았을 때, 신뢰할만한 선형성을 보였으며, 104.5 %의 PCR 효율을 얻었다. 이는 종래의 형광 기반 실시간 PCR 분석법과 견줄만한 결과값이다. 이 방법은 첫번째로 보고되는 서열-특이적 전기화학적 PCR 실시간 진단방식이며, 신호 물질인 금속 이온은 형광 프로브에 비하여 훨씬 안정하여 취급 및 보관에 용이하고 탄소 잉크를 이용한 전극을 사용하여 매우 경제적이다. 이와 같은 장점들로 인하여, 우리가 개발한 전기화학적 PCR 실시간 분석 방법은 휴대용 유전자 진단 시스템의 상용화를 위한 도구로 사용될 수 있을 것이다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCBE 15027
형태사항 x, 111 : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 백송이
지도교수의 영문표기 : Hyun Gyu Park
지도교수의 한글표기 : 박현규
Including Appendix
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 References : p.
주제 electrochemical biosensor
electrochemical diagnostic system
metal-DNA interaction
metal detection
G-quadruplex
molecular beacon
DNA detection
thrombin detection
real-time PCR
전기화학적 바이오센서
전기화학 진단 시스템
금속-DNA 상호작용
금속 검출
G-rich 압타머
분자비콘
DNA 검출
트롬빈 검출
실시간 PCR
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