Biodiesel utilizing microalgae is a new energy source to replace fossil fuel. Among various microalgae species, Nannochloropsis salina has many advantages such as high lipid content, fast growth, and extensive cultivation practice for biodiesel production. As an effort to enhance biomass production in microalgae, we conducted bio-stress experiment by adding bacterial supernatant during the cultivation. These bacteria produce a number of useful materials including antibiotics. Our experimental results showed remarkable changes in microalgal population, size, and growth, when comparing with normal condition. Particularly, culture containing supernatant of KYC2844 strain induced continuous growth of N. salina, while cell growth entered stationary phase in normal condition. Moreover, dry cell weight of cells grown in culture containing 20% supernatant was approximately 20% higher than that in normal condition. Through amino acid analysis, we confirmed this bacterium made ammonia after using amino acid. Taken together, these results suggest that conditioned media of this bacterium can help growth of microalgae.
Genetic engineering in microalgae field is another approach to increase lipid productivity. In plant, most of fatty acids are transported to the endoplasmic reticulum for lipid storage as triacylglycerols. ABCA transporter in plants mediates this transport. According to this concept, we conducted overexpression of ABCA transporter gene for many lipid droplet in N. salina. Furthermore, transformation tool box of N. salina was developed by wave type electroporation with high field strength (2,400 V cm-1) and high number of pulse (50). As a results, ABCA6-5 mutant and ABCA6-14 mutant showed relative high neutral lipid yield compared with wild type of N. salina. In particular, neutral lipid yield of ABCA6-5 mutant was three times higher than that of wild type under N-depleted condition.
미세조류 기반의 바이오 연료 시스템에는 크게 배양, 수확, 추출, 전환의 과정이 있다. 이중 최근에 미세조류를 분자유전학적으로 개량하고, 미세조류의 생리학적 특성을 고려한 효율적인 배양방법을 개발하고자 하는 움직임이 활발하다. 이러한 점에 의거하여, 본 연구는 박테리아가 Secretion시키는 물질을 이용해서 미세조류 배양에 적용해 보았고, 미세조류의 생물학적 개량을 위해 유전자조작을 위한 효율적인 시스템을 개발하였다. 동시에, 유전자 과 발현을 통하여 지질이 많은 뮤턴트를 생산하였다.
효율적인 배양 시스템 구축을 위해, 본 실험은 점액세균을 이용하여 진행되었다. 점액세균은 굉장히 많은 Secondary metabolite을 생산하며, 항생제와 같이 의학적, 산업적으로 유용한 물질을 생산하는 균주이다. 점액세균의 상등액을 분리하여 미세조류 배양에 적용해본 결과, 크게 3가지로 구분 되는 Phenotype이 관찰 되었다. 첫 번째로 점액세균에 의해 미세조류의 세포 크기가 증가되는 효과를 보았다. 지름의 크기가 일반 미세조류보다 약 3배이상 증가됨을 확인하였다. 크기가 커진 세포를 이용하여 형질전환을 해본 결과, 일반 세포보다 2배가 높은 형질전환 효율을 얻을 수 있었다. 또한 미세조류의 생장을 철저하게 억제하는 효과를 보이는 종과 미세조류의 생장을 촉진시키는 효과를 보이는 종도 확인 되었다. 미세조류의 생장을 촉진시키는 효과를 가진 점액세균의 상등액을 농도 별로 진행해본 결과, 20%의 상등액이 미세조류 배양액에 들어간 결과, 약 20%의 증가된 바이오매스를 확보 할 수 있었다. 또한, 미세조류 나노클로롭시스 살리나의 경우, N source로 NH4+의 형태를 NO3- 형태보다 선호하는 특징을 확인 하였다. 결론적으로, 세포에 영향을 주는 상등액의 물질을 분리가 되고 분석이 된다면 효율적인 미세조류 배양 시스템에 큰 도움을 줄 수 있을 것이라 기대한다.
높은 지질을 함유한 우량 균주 생산에 앞서, 본 실험은 형질전환 효율을 개선시키고자 기존의 Electroporation 방법을 개선해 보았다. 일반적으로, 기존의 긴 시간 동안 한번의 Pulse를 미세조류에 주는 방식과 다르게, 짧은 시간 동안 많은 Pulse를 미세조류에 줌으로써, 기존의 형질전환 효율보다 6배가 높은 효율을 얻었다. 얻은 형질전환 시스템을 이용해서, ABCA transporter유전자를 과 발현 시켰다. ABCA transporter는 지방산을 막 안/밖으로 이동시켜주는 통로로써, 많은 지방산들이 지질합성에 사용되길 기대하며, 유전자조작을 시도하였다. 그 결과 유전자 과발현 뮤턴트 ABCA6-5 의 경우, N-depleted배지에서 기존의 세포보다 3배 이상 높은 중성 지질 생산성을 보였다. 미세조류의 유전자의 조작을 통하여, 지질함량이 높은 미세조류를 생산할 수 있음을 본 실험을 통해 보였다.
