Foot-and-Mouth Disease (FMD) is representative diseases rising economical losses in livestock farming. For the effective control of the FMD, it is important to develop effectual vaccines as well as rapid diagnosis systems against its etiological agent, FMD virus (FMDV). In this study, various regulation systems were developed for the vaccination and treatment based on serotype O FMDV VP1. First, epitope was developed to express the FMDV VP1 structural protein with high solubility in large-scales, as available subunit vaccines. To produce high level FMDV VP1 epitope specific to serotype O, representable varieties of O FMDV VP1 epitope were profiled in sequence levels for broad utilization and constructed a glutathione S-transferase (GST) fusion protein in Escherichia coli. For the high-level production, fed-batch cultures were conducted in 5 L bioreactors. After purification, the VP1 epitope was immunized to rabbits and confirmed its immunoreactivity. However, epitope based vaccine system is required a substantial adjuvants to stimulate immune responses. Secondly, FMDV VP1 of serotype O was displayed at platform of the capsomeres and virus-like particles (VLPs), consist of highly repetitive structures without any genetic materials. Self-assembled capsomeres were generated from epitope displayed monomers by cleavage of GST tag. VLP structures were induced by cell-free assembly via in vitro serially dialysis. Morphologies of both capsomeres and VLPs were confirmed by Transmission Electron Microscopy. Increased immunoreactivity was validated at capsomeres by dot-blotting analysis. These advanced vaccine formats can improve the efficiency of the productivity for FMD vaccine. Lastly, synthetic libraries, containing antibody pools recognizing any possible antigens, were manufactured and expressed in E. coli. With APEx (Anchored Periplasmic Expression) display system, developed epitope of the FMDV VP1 were introduced to the synthetic libraries and high-throughput screening carried out specific cells response to this epitope. These cells represent putative monoclonal antibodies specific to FMDV VP1. These monoclonal antibodies were optimized in E. coli and affinity of these antibodies was primarily confirmed by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) test. Selected antibody cadidates were engineering by error-prone PCR and sub-nanomolar level affinity was confirmed Finally, bindings of scFv monoclonal antibody with inactivated FMD virus suggest usage of this antibody for FMD diagnosis as well as passive immunity. In this study, three types of vaccine candidates (epitope, capsomeres, VLPs) enable to induce fast inhibition against FMD and to screen monoclonal antibodies. These developments can apply the prevention and treatment of FMD.
구제역은 축산업에 많은 경제적 손실을 유발하는 대표적인 질병이다. 구제역을 효과적으로 제어하기 위해서는 그것의 병인체인 구제역 바이러스에 대한 효율적인 백신의 개발 및 진단의 시스템을 구축하는 것이 매우 중요한 요소이다. 본 연구에서는, 혈청형 O형 구제역의 예방 및 치료를 위해 다양한 제어 시스템을 개발하였다.
먼저 단위 백신으로 활용가능한 구제역 바이러스의 구조 단백질 VP1의 항원 결정기를 대량으로 생산하였다. 혈청형 O형 구제역에 폭넓은 활용을 위하여 대표성을 갖는 VP1 항원 결정기의 서열을 분석하여 결정하였고, 이 유전자는 GST융합 단백질의 형태로 대장균에서 대량으로 생산되었다. 높은 수준의 생산성을 보장하기 위하여, 5L 배양기에서 유가식 배양법을 이용하였다. 발현 / 정제 후에 VP1 항원을 토끼에 면역하였고, 거기서 얻어진 혈청이 면역적으로 활성을 가짐이 확인되었다. 그러나, 항원 결정를 기반으로하는 백신 시스템은 추후 면역 반응을 적절하게 자극시키기 위하여 별도의 면역 보조제를 필요로 한다.
따라서, 다음으로 혈청형 O형 구제역 VP1 항원을 캡소미어 및 유전 물질을 가지고 있지 않으며 고도로 반복적인 구조를 가지고 있는 바이러스 유사입자에 돌출 시켜서 연구를 진행하였다. 캡소미어는 GST 표지자의 절단에 의하여 자가 조립되어 만들어 지고, 이를 바탕으로 바이러스 유사입자는 캡소미어로부터 시험관내에서 연속적인 투석 과정을 통하여 유도된다. 캡소미어와 바이러스 유사입자의 구조적 특징은 투사 전자현미경을 통하여 그 모습이 검증 되었다. 캡소미어에서는 점블럿검정 분석을 통하여 면역활성의 증가를 확인할 수 있었다. 이러한 개선된 형태의 백신은 구제역 백신의 생산성에서의 효율을 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.
마지막으로 모든 항원에 대하여 항체를 만들어 낼 수 있는 합성 항체라이브러리를 구축하고 대장균에서 이를 발현하였다. 대장균 내막에 항체를 고정시키는 시스템을 이용하여 구제역 바이러스 VP1 에 특이적인 항체를 고효율 유세포 분석기를 통하여 후보 물질을 발굴하였다. 이러한 단일항체는 대장균에서 적절하게 최적화되었고, 효소결합 면역흡착 분석법을 통하여 그 친화도가 검증되었다. 일차 선별된 단일항체는 실수유발 PCR을 이용하여 그 친화도를 추가 개량하였다. 최종 얻어진 단일항체의 친화도는 나노몰 이상의 매우 높은 수준으로 개선되었다. 이렇게 얻어진 항체는 구제역 진단 및 수동 면역치료에 활용될 수 있을 것이다. 본 연구를 통하여 개발된 다양한 제어 시스템은 구제역의 빠른 전파를 막는데 적용될 수 있을 것이다.
