Biopanning using the peptide library displayed on M13 phages is the most convenient method to discover high affinity peptides against specific target. Microfluidic biopanning can reduce the sample size and improve repro-ducibility of biopanning, however, there is no practical guideline for experimental conditions such as an incuba-tion time, a washing flow rate, and an elution flow rate. Here we report the microfluidic platforms for biopan-ning against streptavidin and gold to optimize experimental conditions and discover the gold binding peptide. The binding and elution dynamics of M13 phage displaying histidine-proline-glutamine (HPQ), which is a strep-tavidin-binding peptide motif, on the tail to streptavidin immobilized via biotin-polyethylene glycol in a polydi-methylsiloxane microfluidic channel. The phages bound to streptavidin are eluted using an acidic buffer that weakens the bonding of HPQ to streptavidin. The washing flow rate was optimized at flow rate 0.28 mL min-1 for 1.1 min after the incubation flow at 1 μL min-1 for 30 min.
By using the optimized experimental conditions, gold biopanning was performed within the microflu-idic platform composed of PDMS channel on the gold patterned glass substrate. The gold binding peptide (GTGSQAS; Gly-Thr-Gly-Ser-Gln-Ala-Ser) was successfully identified against target gold surface through the microfluidic platform. In comparison with two other gold binding peptides having similar length with GTGSQAS, the GTGSQAS has a highest affinity confirmed by surface plasmon resonance (SPR) biomolecular interaction analysis. The superiority of affinity was explained by the structural flexibility of the GTGSQAS peptide predict-ed by molecular dynamic simulations.
Our work provides a practically useful approach to the optimization of experimental conditions for the design of a microfluidic biopanning platform, which has a great potential to improve the efficiency and reli-ability of the biopanning process. By extension, this study will help to design total biopanning system including various post-biopanning processes such as neutralization and amplification of eluted phages.
펩타이드 라이브러리가 발현된 M13 파지를 이용한 바이오패닝은 특정 목표물질에 선택적으로 강하게 결합하는 펩타이드를 발굴해 내는데 널리 쓰이고 있다. 필요로 하는 펩타이드를 효과적으로 선별해 내기 위해선 바이오패닝시 강하고 일정한 세척과정이 필수적이다. 미세유체칩을 이용한다면 강하고 재현성 높은 세척환경을 구성함은 물론 적은 시료만으로도 바이오패닝이 가능하다. 이러한 장점을 토대로 바이오패닝을 위한 미세유체플랫폼들이 개발되어 왔지만 미세채널 내에서 파지의 결합과 세척과 관련한 구체적인 분석이 연구되지 않았다.
따라서 본 연구에서는 스트렙타비딘이 벽면에 고정된 미세채널에 스트렙타비딘과 결합한다고 알려진 HPQ 모티브가 발현된 파지를 주입하여 여러 조건에서의 결합과 세척 경향을 확인해보았다. 스트렙타비딘은 유리와 PDMS표면에 바이오틴이 결합된 폴리에틸렌 글리콜 고분자를 처리하여 이를 통해 고정시켰다. 스트렙타비딘과 결합한 파지는 산성을 띄는 버퍼용액을 흘려서 용출시켰다. 세척유량과 시간 및 결합 시간을 변화시켜가며 용출되는 파지 수를 측정한 결과, 파지용액을 오랫동안 흘려주더라도 결합하는 파지의 수에는 큰 영향이 없었다. 세척 유량의 경우, 0.28 mL min-1 로 1.1분간 가해줬을 때 효과적으로 비특이적으로 결합한 파지가 세척됨을 확인할 수 있었다.
앞서 확인한 실험조건을 이용하여 금에 대한 바이오패닝을 미세채널에서 진행했다. 바이오패닝은 바닥면에 금이 증착된 PDMS 채널을 이용하였으며 이를 통해 금 결합 펩타이드(GTGSQAS; Gly-Thr-Gly-Ser-Gln-Ala-Ser)를 발굴해냈다. SPR 분석을 통해 확인한 결과, 앞서 보고된 비슷한 길이의 금 결합 펩타이들에 비해 금에 대해 더 높은 결합력을 갖는 것으로 확인되었고 이는 높은 결합속도상수로부터 기인한다는 것을 알 수 있었다. 바이오패닝 시 사용된 금 패턴이 [111] 결정면을 나타낸다는 것을 실험으로 확인한 뒤, 금[111] 결정면과 금 결합 펩타이드들의 결합을 분자동역학 시뮬레이션을 통해 분석했다. 이를 통해 미세채널을 통해 발굴해낸 펩타이드는 다른 펩타이드들에 비해 적은 내부 수소결합과 소수성 결합에 의해 구조적으로 유연하여 금 표면에서 결합형태로 쉽게 변함을 확인할 수 있었다.
간단한 형태의 미세유체시스템에서의 최적의 바이오패닝 실험조건을 확인했고, 이러한 실험조건은 바이오패닝을 위한 미세유체시스템 제작에 범용적으로 사용 가능할 것이다. 이를 통해 효과적이고 높은 재현성을 갖는 바이오패닝이 가능할 것이며, 더 나아가 파지의 증폭 및 분리정제가 가능한 미세칩들과 결합하여 바이오패닝의 모든 과정이 가능한 미세시스템 구축이 가능할 것이다.
