The innate immune system provides a first defence against microbial invasion through phagocytosis and the induction of inflammation. When the host cell is infected with a virus or bacteria, microbial pathogens release various types of nucleic acids into the cytoplasm. Many DNA sensors (DAI, IFI16, DDX41, DNA-PK, MRE11, cGAS) in cyto-plasm detect these different types of nucleic acids, activate STING-dependent signaling pathway, and induce type I interferon. Numerous DNA sensors have been discovered in the cytoplasm but there is a lack of understanding of why so many DNA sensors exist and how they interact with each other. Among the many unanswered questions, we proceed with a structural and functional study of the N-terminal domain of cGAS and study the binding characteristics of DNA sensors with their binding partners.
The cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is activated upon DNA interaction and catalyzes the synthesis of a cyclic dinucleotide, c[G(2’,5’)pA(3’,5’)p], from ATP and GTP. However, research to date has been conducted on the N-terminal (~150a.a) deficient do-main of cGAS. We purified solely the N-terminal domain of cGAS and conducted a struc-tural study of the dsDNA binding region and observed in-vitro assay for cGAS activity to describe the effect of the N-terminal domain on cGAS’s enzymatic activity. It showed that N-term cGAS was induced conformational change of structure by binding with dsDNA through CD and NMR. N-term cGAS is converted to a structure having a partially short α-helix and β-sheet with dsDNA from a complete random coil without dsDNA. N-term cGAS will bind with dsDNA through charge-charge interaction at induced helixes of around T23, R48, A68, and M80. It observed that N-term cGAS causes the differences of binding affinity of cGAS and ΔN-cGAS with dsDNA and the binding affinity of ΔN-cGAS and dsDNA depends on dsDNA length through ITC. We thought that it is necessary to check the effect of N-term cGAS on the enzymatic activity of cGAS. The ΔN-cGAS’s enzymatic activity, producing 2’, 3’ cGAMP, was reduced more than 15% compared to the full-size cGAS’s enzymatic activity. Whereas cGAS produces a similar amount of 2’, 3’ cGAMP independently of the DNA length, the amount of produced 2’, 3’ cGAMP by ΔN-cGAS was reduced according to the longer DNA. And the reduced activity of ΔN-cGAS was reconstructed when ΔN-cGAS was reacted with separately purified N-term cGAS. Through these results, we thought that N-term cGAS functions as a co-effector in the enzymatic activity of cGAS.
Several biochemical experiments were proceeded to study the binding characteristics of DNA sensors with binding partners. First, the binding of STING-CTD with dsDNA and c-di-GMP was found through EMSA and ITC. The binding affinity of STING-CTD with c-di-GMP is 0.21uM and is much stronger than with dsDNA (14.12uM). Interestingly, the energy difference (ΔH) in the binding reaction of STING-CTD and dsDNA is about 10-fold greater than in the binding reaction of STING-CTD and c-di-GMP. It is thought that the substantial energy difference (ΔH) of binding STING-CTD with dsDNA is derived by a conformational change due to the binding of STING-CTD with dsDNA. The binding affinity of the complex of STING-CTD and c-di-GMP with dsDNA was measured as 24.5uM and is similar to the binding affinity of STING-CTD with dsDNA (14.12uM). It can be seen that STING-CTD has different binding sites for c-di-GMP and dsDNA. Second, the interaction of DDX41 and the binding partner, dsDNA, c-di-GMP and STING, was confirmed through ITC. DDX41 directly binds STING-CTD. The complex of DDX41 with dsDNA also can bind STING-CTD and the binding affinity is stronger than the interaction of DDX41 and STING-CTD without dsDNA. Finally, it was not confirmed that intramolecular interaction between HINa, HINb and PYD of IFI16 and combination with STING-CTD. The function of HINa and PYD of IFI16 is still not clear, and therefore additional study is required with regard to the function of HINa and PYD, localization of IFI16, and identifying the inflammasome induction mechanism.
선천성 면역시스템은 미생물의 침입에 대항하여 식균작용과 염증반응으로 첫번째 방어막을 제공한다. 숙주세포에 바이러스나 박테리아가 감염되면, 미생물 병원체들은 다양한 종류의 핵산물질을 세포질로 배출한다. 세포질에 존재하는 많은 DNA 센서들은 (DAI, IFI16, DD41, DNA-PK, MRE11, cGAS) 이러한 다양한 종류의 핵산물질을 인식하고, STING에 의존하는 신호전달 체계를 활성화시켜 1형 인터페론을 유도한다. 다수의 DNA 센서들이 세포질에서 발견되었지만, 왜 그렇게 많은 DNA 센서들이 존재하는지, 어떻게 그들이 서로 상호작용하는지에 대한 이해가 부족하다. 아직 밝혀지지 않은 의문들 중, 우리는 cGAS의 N-말단 도메인의 구조적 기능적 연구를 수행하였고, DNA 센서들과 리간드들 간의 결합특성을 연구하였다.
Cyclic GMP-AMP 합성효소 (cGAS)는 DNA결합으로 활성화되고, ATP와 GTP를 이용하여 cyclic dinucleotide, 2’, 3’ cGAMP, 를 합성한다. 그러나 현재까지의 연구는 cGAS의 N-말단부분 (~150 a.a.)이 제거된 도메인을 가지고 진행되었다. 우리는 cGAS의 N-말단부분을 따로 정제하여 DNA결합에 대한 구조적 연구를 수행하였고, cGAS의 효소 활동에서 N-말단 메인의 효과를 설명하기 위해 cGAS의 효소활동성을 관찰하였다. cGAS의 N-말단부분은 dsDNA와의 결합으로 구조적 변화가 유도되었다. cGAS의 N-말단의 구조는 완전한 랜덤코일에서 dsDNA와의 결합으로 부분적으로 짧은 α-helix와 β-sheet를 가지는 구조로 변화하였다. cGAS의 N-말단부분은 T23, R48, A68, M80근처의 유도된 helix들과 charge-charge in-teraction을 통해 DNA와 결합할 것이다. cGAS의 N-말단부분은 cGAS와 ΔN-cGAS의 DNA결합강도의 차이에 원인이 되고, ΔN-cGAS와 dsDNA의 결합강도는 dsDNA의 길이에 따라 달라진다는 사실을 확인하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 우리는 cGAS의 효소활성에서도 cGAS N-말단의 효과를 확인하는 것이 필요하다고 생각했다. 2’, 3’ cGAMP를 생산하는, ΔN-cGAS의 효소활성은 전체 cGAS의 효소활성과 비교하여 15%이상 감소하였다. 전체 cGAS가 DNA의 길이에 관계없이 비슷한 양의 2’, 3’ cGAMP를 만드는데 반해, ΔN-cGAS에 의해 만들어지는 2’, 3’ cGAMP의 양은 DNA가 길어질수록 감소하였다. 그리고 감소된 ΔN-cGAS의 효소활성은 따로 정제된 cGAS 말단부분을 넣어주자 회복되었다. 이러한 결과들을 통해, cGAS의 N-말단부분이 cGAS의 효소활성에서 co-effector로써의 역할을 하는 것으로 보인다.
DNA 센서들과 결합파트너간의 결합적 특성들을 연구하기 위해 여러 생화학적 실험들을 수행하였다. 첫번째로, STING의 C말단 부분과 dsDNA, c-di-GMP와의 결합을 EMSA와 ITC를 통해서 확인하였다. STING의 C말단 부분과 c-di-GMP와의 결합강도는 0.21uM로 dsDNA와의 결합강도 (14.12uM)보다 강했다. 흥미롭게도, STING C말단과 dsDNA의 결합반응의 에너지차이는 c-di-GMP와의 결합반응에서의 에너지 차이보다 10배정도 컸다. 이러한 에너지의 차이는 STING의 C말단과 dsDNA의 결합으로 인해 만들어지는 구조적 차이에 의해 만들어진다고 생각할 수 있다. STING C말단과 c-di-GMP의 복합체와 dsDNA와의 결합강도는 24.5uM로, STING C말단과 dsDNA와의 결합강도 (14.12uM) 와 비슷한 수준을 보였다. 이를 통해 SITNG C말단에서 c-di-GMP과 dsDNA가 서로 다른 결합자리를 가지고 있는 것을 알 수 있다. 두번째로, DDX41과 결합파트너들 (dsDNA, c-di-GMP, STING) 의 결합강도를 ITC를 통해 확인하였다. DDX41은 STING C말단과 직접적으로 결합하였다. DDX41과 dsDNA와의 복합체 또한 STING C말단과 결합할 수 있는데, 결합강도가 DDX41과 STING C말단과의 결합보다 강하다는 점을 확인하였다. 이는 dsDNA와의 결합에 의해 일어나는 DDX41의 어떤 구조적인 변화가 STING C말단과 상호작용을 더 잘하게 한다는 점으로 생각할 수 있다. 마지막으로, IFI16의 HINa, HINb, PYD 도메인들간의 분자내 상호작용과 STING C말단과의 결합은 확인되지 않았다. 그래서 IFI16의 HINa, PYD 도메인들의 역할은 아직 명확하지 않으므로, HINa와 PYD 도메인들의 기능, IFI16의 위치변화, 염증반응을 유도하는 메커니즘을 규명하기 위한 추가적인 실험이 필요하다.
