Reactive oxygen species (ROS) regulate various biological processes by modifying reactive cysteine residues in the proteins participating in the relevant signaling pathways as a main part of post-translational modification. Identification of the ROS target proteins requires specific reagents that identify the ROS sensitive cysteine sulfhydryls that differ from the known alkylating reagents, iodoacetamide and N-ethylmaleimide due to their non-specific reactivity with oxidized cysteines including sulfenic and sulfinic acid. To circumvent the shortcomings of currently used alkylating agents, we have designed and synthesized a novel reagent, methyl-3-nitro-4-(piperidin-1-ylsulfonyl)benzoate (NPSB-1). Specificity of NPSB-1 toward the free sulfhydryls of cysteine residues were verified in the model compounds. The specificity and reactivity of NPSB-1 in the real biological system was validated with various recombinant proteins by peptide sequencing with tandem mass spectrometry and mutant studies. For purified protein identification, unneccesary biotin linker is cleaved to obtain strong signal ion in tandem mass spectrometry after enriched through affinity purification. Newly designed cleavable linker probe inspired by staudinger reaction strategies which was the well known reaction between phosphine and azide to cyclize lactam. It can obtain the lactam by adding water soluble phosphine ligand without acidic or basic chemical treatment. The newly designed cleavable linker can be useful tool for proteomics to analze the post-translational modifications of proteins.
Chemical post-translational modification of proteins offers incorporation of both natural and unnatural amino acid residues in proteins that are not accessible using standard site-directed mutagenesis. In an effort to introduce natural, unnatural, and modified natural amino acids in proteins, dehydroalanine (Dha) offers a unique chemical handle for modifications as nucleophiles can undergo 1,4-addition reaction with Dha. As an extension of the repertoire of nucleophiles, we applied the 1,4-addition of alkyl iodides to α,β-unsaturated carbonyl systems using zinc and copper in aqueous media through C-C bond formation. In the presence of zinc and copper, unnatural amino acids were prepared in high yields, including tolerance to a wide range of functionality. Further, the peptide including Dha can be converted in alkylated products without organic solvent. We have developed a method for generating the radical effectively by using zinc-copper metal in water and subsequent reaction with peptides or proteins containing Dha.
1. 단백질 내 시스테인 변형 확인 및 분석에 유용한 물질 합성에 관한 연구
단백질 내 시스테인은 1~2%의 적은 양으로 존재하지만 효소의 활성자리, 단백질 구조 및 기능발현에 중요한 역할을 한다. 이러한 시스테인은 활성산소에 의해 쉽게 산화되며, 이때 생성된 산화물은 세포 증식, 변이, 감염을 포함하여 파킨슨병 및 알츠하이머를 촉진시킨다. 하지만 정확한 메커니즘이 밝혀지지 않았고, 변형 단백질의 활성자리에 대한 정보가 부족하므로 이에 대한 연구가 필요하다. 단백질의 활성자리를 파악하기 위해서 시스테인의 싸이올기에만 선택적으로 반응하는 특이성을 가진 구조의 화합물이 필요하다. 기존의 싸이올기 반응 물질들로 아이오도아세트아마이드와 에틸말레이미드가 존재하지만, 이들은 모두 시스테인의 산화물인 설페닉산과 설피닉산에도 반응하므로 선택적 반응성이 없다. 이러한 단점을 극복하기 위해 메틸-3-니트로-4-(피페리딘-1-일설포닐)벤조에이트(NPSB-1)와 바이오틴을 붙인 NPSB-B를 합성하였다. 위의 물질은 아민의 보호기로 알려져 있는 노질기를 변형한 것으로 싸이올기에만 선택적으로 반응함을 확인하였고, 시스테인을 포함한 단백질의 활성자리에도 선택적으로 반응함을 확인하였다. NPSB와 단백질 결합물을 분석하기 위하여 탠덤질량분석기를 이용한다. 분석의 용이성을 위해, 질량분석 전 불필요한 바이오틴 결합을 끊어주어 원하는 질량을 가진 이온을 확인하도록 화합물을 구상하였다. 스타우딩거 반응을 이용하여 포스핀과 아자이드의 결합으로 락탐고리를 만들며 바이오틴이 끊어지도록 화합물을 구상하였으며, 위의 반응은 수용액의 산도와 무관하게 일어날 수 있기 때문에 단백질에 영향을 미치지 않는 장점이 있다. 이렇게 개발된 물질은 질량분석에 용이하게 쓰일 수 있으며, 단백질 변형 연구에 중요한 분석도구로 쓰일 것으로 기대하고 있다.
2. 아연을 이용한 C-C 결합으로 수용액 중 아미노산 합성에 관한 연구
단백질 변형 메커니즘을 밝히고 그 기능을 확인하기 위해, 천연 및 비천연 아미노산의 합성연구가 활발히 진행되고 있다. 대부분 단백질 합성은 디옥시리보 핵산(DNA) 단계에서 조절되며 20개의 아미노산 이외의 비천연 아미노산의 합성은 전사 후 번역단계에서 주로 일어난다. 기존의 단백질 변형 반응은 전이금속을 이용한 반응들로 천연 아미노산에 직접 반응하는 방법과 반응성 있는 작용기를 가진 아미노산을 합성하여 헥, 소노가시라, 스즈키, 아자이드-알카인[3+2] 및 호베이다 그럽스 촉매를 이용한 반응법들이 있다. 위의 반응들은 특정한 작용기를 가져야 하므로, 기존의 합성법으로 다양한 아미노산을 합성하기에 한계가 있다. 따라서 변형된 아미노산을 합성하기 위해 새로운 C-C결합 형성반응을 개발하였다. 개발된 C-C결합 형성 반응은 알파, 베타-불포화카보닐구조를 가진 디하이드로알라닌(Dha)에 아연을 이용한 1,4-첨가반응으로, 아연과 구리 금속을 이용하여 알킬라디칼을 형성하므로 수용액상에서 안정하게 반응할 수 있다. 다양한 알킬아이오다이드를 이용하여 높은 수득률로 비천연 아미노산을 합성하였고, 위 반응을 이용하여 메틸, 디메틸 및 트라이메틸 라이신 유도체들을 처음으로 합성하였다. 트라이펩타이드에서도 반응이 진행되었으므로, 단백질에서의 아미노산 합성 가능성을 확인하였다. 특히, 라이신 유도체들은 히스톤 단백질에서 주로 발현되며 위 변형의 작용 메커니즘과 영향에 대한 연구가 미흡하므로, 개발한 합성방법을 이용하여 비천연 아미노산을 도입함으로써 단백질 변형 연구에 도움을 줄 것으로 기대하고 있다.
