Since the micro electro mechanical systems (MEMS) technology introduce to the chemical and biochemical assays, lab on a chip (LOC) or micro total analysis systems (μTAS) has been developed over the decades in the field of clinical diagnosis, forensic analysis, food safety testing, and environment screening. The microfluidic-based μTAS has strong advantages including rapid analysis time, reduced sample consumption, easy to integration of each steps, high throughput capability and portability for on-site detection. Taking advantages of microfluidic-based device, a fully integrated microdevice developed and applied for pathogen or genetic analysis with sample-in-answer-out capability. However, the existing total integrating microdevices need to overcome several drawbacks such as necessity of external system for controlling micropump, microvalve, and fluid, construction of miniaturized detection system, and human intervention. Therefore, in this thesis, we announce a total integrated slidable genetic analysis system which is fully integrated all the functional units for genetic analysis on a single wafer which including DNA extraction, polymerase chain reaction (PCR), detection units such as immunochromatographic strip, and capillary electrophoresis, and portable genetic analyzer.
In Chapter 3, pathotyping and subtyping of influenza A virus were performed with a packaged paper fluidic-based analytical microdevice (PFAM) after one-step reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The PFAM contains two test lines: one for detecting M gene to identify the influenza A virus and the other for haemagglutinin subtyping to determine the viral strain among H1N1, H3N2, and H5N1. The M gene and the haemagglutinin gene (H1, H3, and H5 gene) were amplified by using the Digoxigenin and the Texas Red modified primers, respectively, in the multiplex RT-PCR. The amplicon products were loaded in the conjugate pad of the PFAM, in which the streptavidin coated gold nanoparticles were linked with the biotin moieties that were incorporated in the middle of the DNA strands, and then captured by the anti-Digoxigenin and anti-Texas Red immobilized on the test lines. Influenza A H1N1, H3N2, and H5N1 could be identified with a limit of detection of 10^2 copies of RNA templates in 10 min. Pathotyping and subtyping of the clinical nasopharyngeal swab samples were also analyzed whose results were confirmed by real-time RT-PCR.
In Chapter 4, an integrated microdevice of an RT-PCR reactor and an immunochromatographic strip was constructed for colorimetric detection of gene expression of influenza A virus subtype H1N1. An RT-PCR cocktail, which included Texas Red-labeled primers, dNTP including biotin-labeled dUTP, and RNA templates of influenza A H1N1 virus, was filled in the PCR chamber through the micropump, and the RT-PCR was performed to amplify the target H1 gene (102 bp). The resultant amplicons bearing biotin moieties and Texas Red haptens were subsequently eluted to the immunochromatographic strip, in which they were first conjugated with the gold nanoparticle labeled antibody, and then captured on the streptavidin coated test line. By observing a violet color in the test line, we confirmed the H1N1 target virus. The entire process on the integrated microdevice consisting of a micropump, a 2 μL PCR chamber, and an immunochromatographic strip was carried out on the portable genetic analyzer within 2.5 hr, enabling on-site colorimetric pathogen identification with detection sensitivity of 14.1 pg RNA templates.
In Chapter 5, a total integrated sample-in-answer-out microsystem was developed which was contained of solid phase extraction (SPE), PCR, immunochromotographic strip (ICS) zone for multiplex colorimetric detection of staphylococcus aureus (S. aureus) and Esterichia coli (E. coli) incorporated with a portable genetic analyzer. Utilizing a slidable chamber which is a movable glass wafer, microvalves and micropumps could be removed from integration system. The integrated slidable microdevice was composed of 4 layers including a 4-point Pt/Ti resistance temperature detector (RTD) wafer, a micro-patterned channel wafer, 2 μL-volume of slidable chamber, and ICS. The entire process on the slidable microchip was sequentially performed by simply sliding the slidable chamber from one to another functional unit. A S. aureus and an E. coli lysate were injected into the SPE chamber for recovering a purified DNA and then, the eluted DNA was mixed with PCR cocktail which include Digoxigenin-labeled S. aureus primers, Texas Red-labeled E. coli primers, and biotin-labeled dUTPs. The mixture solution was directly loaded to the slidable chamber for sample transportation to the each functional unit, PCR, and pathogen detection on the ICS. The Digoxigenin, Texas Red, and biotin bore PCR amplicon was sequentially eluted to the ICS in which the amplicon firstly conjugated with streptavidin coated gold nanoparticle (Au NP), and then captured on the test line 1 and test line 2 which was coated with anti-Digoxigenin, and anti-Texas Red, respectively. The total process on the integrated slidable microchip was carried out on the portable genetic analyzer within 60 min, enables us to detect multiplex colorimetric pathogen identification with 5 cell numbers of detection sensitivity.
In Chapter 6, a capillary electrophoresis (CE) microchip has been presented for stuffer-free multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)-based assay of five foodborne pathogens with single single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. Recent improvements in the MLPA method promise successful multiplex analysis of various genetic markers. In particular, it has been demonstrated that elimination of the stuffer sequence included in MLPA probes for length-dependent analysis substantially simplifies the probe design process and improves the accuracy of the analysis. As is the case for other CE-based methods, MLPA could be further developed on a microchip platform. Microchip channel design and electrophoresis operating conditions were first optimized for reproducible analysis, after which two sieving matrices were tested. Finally, the method was validated using DNA samples isolated from intentionally infected milk.
In Chapter 7, an integrated slidable and valveless PCR and CE microdevice has been developed for pathogen detection on a portable genetic analysis microsystem. The proposed microdevice does not need any microvalve or external pneumatic actuators, thereby simplifying the chip fabrication and the chip operation process. The slidable PCR-CE chip consists of three glass layers: a channel wafer that includes a sample injection and CE microchannel, a Ti/Pt electrode-patterned RTD wafer, and a slidable plate in which a PCR chamber was fabricated. First, the slidable PCR plate was placed in the sample injection zone to load a PCR cocktail, and then moved to the PCR zone for thermal cycling. After PCR, the slidable PCR chamber was switched to the CE region for separation, the resultant amplicons were then analyzed by a miniaturized laser-induced fluorescence detector. Non-specific DNA adsorption was prevented by treating the glass surface with hydrophobic decyltrichlorosilane, and the leakage and evaporation of the PCR cocktail during the movement and PCR could be minimized by surrounding the slidable chamber with mineral oil. The target protein A gene (101 bp) of S. aureus was detected with a limit of detection (LOD) of 6 copies, even with a background of 1000-fold excess of E. Coli K12 templates. This demonstrates a highly sensitive and selective genetic analy-sis was achieved on our slidable and valveless PCR-CE microdevice.
In Chapter 8, a fully integrated slidable and valveless microsystem, which performs SPE, micro-polymerase chain reaction (μPCR) and micro-capillary electrophoresis (μCE) coupled with a portable genetic analyser, has been developed for forensic genotyping. The use of a slidable chip (a 10×10 mm glass wafer), in which a 1 μL-volume of the PCR chamber was patterned at the center, does not necessitate any microvalves and external pneumatic actuators. The functional micro-units of SPE, PCR, and CE were individually fabricated on a single glass wafer by conventional photolithography. The integrated microdevice consists of three layers: from top to bottom, a slidable wafer, a channel wafer in which a SPE chamber, a weir structured microchannel, and CE microchannels were fabricated, and a Ti/Pt RTD wafer. The channel glass wafer and the RTD glass wafer were thermally bonded, and the slidable chip was placed on the designated functional unit and manually moved from one to another. Prior to the chip operation, silica beads were packed into the SPE chamber and the CE channel was filled with a linear polyacrylamide (LPA) gel. Whole human blood sample mixed with a lysis buffer was injected into the SPE unit for genomic DNA extraction. The purified DNA solution was mixed with a PCR cocktail which contained primer sets for typing amelogenin and four mini Y chromosomal short tandem repeat (STR) loci (DYS393, DYS389I/II, DYS390, and DYS439), and then the PCR-ready solution was loaded into the PCR chamber of a slidable chip. The slidable chip was moved to the PCR unit for thermal cycling to amplify STR loci, and then slid to the CE unit for the amplicon separation. Finally, the resultant amplicons were analysed by a miniaturized laser-induced fluorescence detector. Monoplex and multiplex detection of amelogenin and mini Y STR loci were successfully analysed on the integrated slidable SPE-μPCR-μCE microdevice by using 1 μL whole human blood within 60 min. Our proposal provides an advanced genetic analysis microsystem which is capable of point-of-care DNA testing with sample-in-answer-out capability, more importantly, without use of complicated microvalve, micropump, and microtubing systems for liquid transfer and consecutive operation of sample pretreatment, PCR, and CE.
미세전자기계시스템 (Micro electro mechanical systems;MEMS) 기술이 화학 및 생화학 검정에 소개된 후로 랩온어칩(LOC), 또는 미세종합분석시스템(μTAS)을 이용한 기술은 임상진단, 법의학, 식품안전, 환경검사 등의 분야에서 수십 년간 발전되어 왔다. 마이크로플루이딕을 기반으로 하는 미세종합분석시스템은 빠른 분석시간, 적은 시료의 사용, 각 단계의 통합의 용의성, 높은 처리용량과 이동의 간편함 등 여러 가지의 장점을 지니고 있다. 이러한 장점을 이용하여 sample-in-aswer-out이 가능한 완전히 통합된 마이크로 칩 기반의 유전자 분석 장치가 개발되었으며 이를 병원균 진단이나 유전자 분석 등에 적용하였다. 그러나 이렇게 개발된 통합 유전자 진단 장치는 마이크로 펌프나 밸프를 구동하거나 유체의 흐름을 조절하기 위한 외부의 장치가 필요하고 현장진단을 위한 이동형 검출장치 또한 필요하며 잘 훈련된 사람에 의해서만 작동될 수 있는 단점을 지니고 있다. 그리하여 본 학위논문에서는 이러한 점을 보완하여 DNA의 추출에서부터 중합효소연쇄반응 및 면역 크로마토그래피 분석법 또는 모세관 전기영동과 같은 검출 부분을 모두 하나의 칩에 통합시킨 유전자진단 마이크로 통합시스템을 고안하였다.
첫 번째로 인플루엔자 A 바이러스의 병원성과 아류형을 역전사 중합효소연쇄반응 이후 종이를 이용해 진단 할 수 있는 마이크로 장치 (PFAM)의 개발을 수행하였다. 본 마이크로 진단장치는 두 개의 테스트라인으로 구성되어 있는데 인플루엔자 A 바이러스의 M gene을 검출할 수 있는 테스트라인과 haemagglutinin gene을 검출을 통해 H1N1, H3N2, H5N1의 바이러스 중에서 아형을 구분할 수 있는 테스트라인으로 구성되어 있다. M gene과 haemagglutinin gene (H1, H3, H5 gene)은 각각 Digoxigenin과 Texas Red가 포함되어 있는 프라이버를 이용하여 다중 역전자 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 증폭산물을 streptavidin이 코딩되어 있는 금 나노입자가 있는 마이크로 장치의 conjugation pad에 떨어뜨려 증폭과정 중에 DNA 사슬 중간에 넣은 biotin과 결합하게 한 뒤 결합체를 anti-Digoxigen과 anti-Texas Red가 각 각 뿌려져 있는 테스트라인으로 흘려주어 그 곳에 잡히도록 한다. 이 결과 인플루엔자 A H1N1, H3N2, H5N1은 10분안에 10^2 copy 측정 한계값으로 검출할 수 있었고 임상샘플 또한 정확히 검출되었으며 그 결과를 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time PCR)로 확인하였다.
두 번째로 인플루엔자 A 바이러스의 H1N1의 유전자 발현을 발색검출할 수 있는 역전사 중합효소 연쇄반응과 면역 크로마토그래피 분석법이 통합된 마이크로 장치를 개발하였다. Texas Red가 포함된 프라이머와 biotin-dUTP가 포함된 dNTP, 인플루엔자 A H1N1 바이러스의 RNA를 포함한 역전사 중합효소 연쇄반응용 용액을 마이크로 펌프를 이용해 중합효소 연쇄반응 챔버에 넣고 H1 gene을 증폭시켰다. Texas Red와 biotin을 포함한 증폭 산물은 이어서 면역 크로마토그래피 분석 스트립에 흘려주게 되면 먼저 항체가 고정되어 있는 금 나노입자와 결합한 뒤 streptavidin이 뿌려져 있는 테스트라인에 잡히게 된다. 테스트라인의 보라색을 관찰하여 H1N1 바이러스를 확인할 수 있었다. 마이크로 펌프, 2 μL 중합효소 연쇄반응 챔버, 면역 크로마토그래피 분석을 모두 휴대용 유전자 분석장치를 이용해 2시간 30분안에 수행 하였으며 14.1 pg의 RNA도 발색검출이 가능하였다.
세 번째로 고체상 핵산 추출-중합효소연쇄반응-면역크로마토그래피 분석법이 통합된 마이크로 장치를 개발하여 병원체를 발색-다중 검출하였다. 이동이 가능한 슬라이더블 챔버를 이용하여 마이크로 밸브나 펌브가 없는를 통합칩을 제작하였다. 슬라이더블 통합칩은 4개의 층으로 Ti/Pt 전극이 패턴되어 있는 저항 온도 탐지기 (resistance temperature detector; RTD) 웨이퍼, 마이크로 채널웨이퍼, 2 μL 슬라이더블 챔버, 그리고 면역크로마토 그래피 분석 스트립으로 구성되어 있다. 슬라이더블 통합칩은 슬라이더블 챔버를 간단히 움직임으로써 구동되며 먼저 병원균 용리액을 고체상 핵산추출챔버에 넣어 정제된 핵산을 얻어낸 후 Digoxigenin이 포함된 S. aureus 프라이머, Texas Red가 포함된 E. coli 프라이머, Biotin-dUTP가 들어있는 PCR 칵테일과 섞은 후 슬라이더블 챔버에 넣어준다. 슬라이더블 챔버를 PCR 구역으로 이동시켜 Digoxigenin, Taxas Red, Biotin이 포함된 핵산 증폭 산물을 제작하고 다시 슬라이더블 챔버를 이동하여 면역크로마토 그래픽 스트립에 흘려준다. PCR 증폭 산물은 먼저 금 나노입자와 결합하고 차례로 anti-Digoxgenin이 포함된 테스트라인 1과 anti-Texas Red가 포함된 테스트라인 2에 잡히게 되고 여분은 금 나노입자가 코팅된 streptavidin은 biotin이 있는 컨트롤라인에 잡히게 된다. 모든 칩의 구동은 소형화된 장치에서 60분 이내에 이루어졌으며 5개의 셀에서도 발색검출이 가능함을 확인하였다.
네 번째로 다섯 가지의 병원균을 다중 결찰 의존 조사 증폭법 (multiplex ligation-dependent probe amplification; MLPA)을 이용하여 증폭하고 단일쇄 DNA 고차 구조 다형성 (single single-strand conformation polymorphism; SSCP)을 이용하여 모세관 전기영동 마이크로 칩에서 분석하였다. 최근 다중 결찰 의존 조사 증폭법은 다중으로 다양한 유전자 감식을 하는데 있어 촉망받는 방법으로 특히 MLPA 탐침의 stuffer부분을 제거함으로써 탐침의 디자인을 간편하게 하고 분석의 정확도를 높였다. 위의 방법을 통해 증폭한 산물을 검출하기 위해 전기영동법을 대체할 수 있는 마이크로 칩을 이용한 분석 장치를 개발하였다. 재현 가능한 분석을 위해 먼저 마이크로 채널의 디자인과 전기영동 조건을 최적화한 다음 두 가지의 고분자를 이용하여 병원균을 분리하였다. 마지막으로 감염된 우유에서 얻은 병원균의 DNA를 이용하여 입증하였다.
다섯 번째로 밸브 없이 작동할 수 있는 중합효소 연쇄반응과 모세관 전기영동이 통합된 병원균 진단을 위한 휴대용 유전자 진단 시스템을 개발하였다. 제안된 마이크로 장치는 마이크로 밸브나 외부의 공압 구동장치 등이 필요 없어 칩 제조공정과 구동을 간단히 할 수 있는 장점을 지니고 있다. 슬라이더블 중합효소 연쇄반응-모세관 전기영동 통합칩은 샘플 주입채널과 전기영동 마이크로 채널이 있는 채널웨이퍼와 Ti/Pt 전극이 패턴되어 있는 저항 온도 탐지기 (resistance tem-perature detector; RTD) 웨이퍼 그리고 중합효소 연쇄반응 챔버가 패턴되어 있는 슬라이더블 판의 세 개의 층으로 구성되어 있다. 먼저 슬라이더블 중합효소 연쇄반응 챔버를 샘플 주입부에 놓고 중합효소 연쇄반응용 용액을 주입하고 슬라이더블 챔버를 중합효소 연쇄반응 구역으로 이동시켜 유전자 증폭을 수행하고 다시 전기영동 구역으로 이동하여 증폭산물을 분리하여 최종적으로 소형화된 형광 감지기에 의해 증폭산물이 분석되었다. 유리의 표면에 DNA가 흡착되는 것을 방지하기 위해서 소수성의 decyltrichlorosilane을 코팅해주었으며 중합효소 연쇄반응용 용액의 증발을 막고 챔버의 이동간 용액의 새는 현상을 최소화하기 위하여 챔버의 주위를 미네랄 오일로 감싸주었다. 검출하고자 한 황색포도상구균의 protein A gene (101 bp)를 6 copy의 검출한도로 검출하였으며 1000배의 대장균이 있는 환경에서도 잘 검출됨을 확인하였다. 이를 통해 슬라이더블 중합효소 연쇄반응-모세관 전기영동 마이크로칩이 유전자 분석에 있어 높은 민감도와 선택성을 지니는 것을 증명하였다.
여섯 번째로 법의학 분석을 위한 고체상 핵산 추출-중합효소연쇄반응-모세관전기영동법이 통합된 마이크로 장치를 개발하였으며 이를 소형화된 구동 장치를 이용하여 작동하였다. 1 μL 용량의 챔버가 패터닝되어 있는 10 × 10 mm 크기의 슬라이더블 챔버를 이용하여 통합칩 상에 밸브나 펌프 없이 유체를 이동시킬 수 있었다. 통합칩은 광식각공정을 통해 제작되었으며 Ti/Pt 온도저항감지기와 소체상 핵산추출 챔버, 둑모양의 마이크로채널 (weir structured microchannel), 샘플 주입 채널, 전기영동 채널이 패턴되어 있는 마이크로 채널 웨이퍼, 슬라이더블 챔버, PDMS 저장소로 구성되어 있다. 슬라이더블 통합칩을 구동하기 위해 실리카비드를 핵산추출 챔버에 채우고 사람의 전혈을 주입함으로써 DNA를 추출하였다. PCR 증폭 전에 추출된 DNA와 PCR 칵테일을 섞고 그 후 용액을 슬라이더블 챔버에 넣어 주었다. 다음, 슬라이더블 챔버를 열 사이클을 위해 PCR 구역으로 이동하고 증폭산물 분리를 위해 전기영동 구역으로 이동시켰다. 목표한 증폭산물은 소형화된 레이저 유도 형광검출장치를 통해 확인하였다. 1 μL의 인간의 전혈을 이용하여 Amelogenin과 4개의 Y 염색체 단연쇄반복구간 (DYS393, DYS389I/II, DYS390, DYS439)을 60분 안에 검출하였다. 이 시스템은 펌프나 팰브없이 액체를 이동시킴으로써 랩온어칩의 단점을 극복한 완전히 통합된 sample-in-answer-out 형태의 마이크로 시스템을 구축하였다.
