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Mussel-inspired adhesives for surface functionalization and stem cell microenvironment engineering = 홍합 모사 접착제를 이용한 표면 기능화 및 줄기 세포 미세 환경 조절
서명 / 저자 Mussel-inspired adhesives for surface functionalization and stem cell microenvironment engineering = 홍합 모사 접착제를 이용한 표면 기능화 및 줄기 세포 미세 환경 조절 / Mihyun Lee.
저자명 Lee, Mihyun ; 이미현
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2015].
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Biomimetic approach often holds a clue to achieve a breakthrough in various fields of science and technologies. In the surface chemistry, the mussel-inspired catecholamine adhesive is one of the most powerful biomimetic techniques for surface functionalization. Similar to mussel’s versatile adhesion, catecholamine adhesives represented by dopamine enable material-independent surface coatings and functionalization and thus have been extensively utilized in various research areas of biomedical science, energy, and environmental applications. In the present thesis, the author investigated various surface functionalizations by catecholamine adhesives and applied them for stem cell microenvironment engineering as practical applications of mussel-inspired adhesives. In chapter 1, the background of the research was concisely described. At first, the versatile chemical and physical characteristics of dopamine were described. General information and some examples of dopamine chemistry and application can be found. Subsequently, the history and significance of the microenvironment engineering of stem cells were introduced. Challenges and trials for in-vitro expansion of stem cells were described. The aim of study was remarked at the last in this chapter. In chapter 2, the functionalization of micro-bead surfaces and its interaction with various materials were studied. Substrate-bound catecholamine adsorbent was readily prepared by coating silica micro-beads with an adherent film of polydopamine, which exhibits a high affinity for metal ions. A variety of heavy metals and a radioisotope were efficiently adsorbed on polydopamine-coated silica beads in mild aqueous solutions. Furthermore, an amine-containing organic molecule was also found to be adsorbed on the surface. We attributed the adsorption of organic molecule to the reactivity of the catechol with amines and thiols. In addition, the interactions between metals and polydopamine were interrupted by acid treatment, and the polydopamine coating was bleached by hydrogen peroxide treatment. In chapter 3, a strategy for rapid preparation of genuine catecholamine coating was described. For the practical use of polydopamine in large-scale, slow oxidative coating kinetics (typically ~18 h for 50 nm coating) should be overcome because it leads to high cost and low process efficiency. We found that oxidative coating process of polydopamine was largely accelerated by irradiation of microwave, which enabled the formation of ~18 nm-thick coating in 15 min. The atomic composition of prepared polydopamine coating by microwave was very similar to conventional coating method.We revealed the acceleration of coating process by microwave originated from temperature increase and radical generation during irradiation, which enabled thermally accelerated radical polymerization of dopamine. We expect this simple rapid coating method would greatly enhance efficiencies of various cate-cholamine applications and practical use of polydopamine. Chapter 4 describes a functionalization of ultra water-repellent surface by polydopamine in aqueous solutions inspired by unique surface properties of desert beetles Stenocara’s back. The functionalized surface enabled completely new approach for the engineering of cellular organization. Spheroids provide natural 3D environments in which cell-to-cell communications dramatically enhance the biological activities of the cells. For the fabrication of spheroid-forming platform, the micro-sized hydrophilic patches were introduced to the superhydrophobic background surfaces via mussel-inspired polydopamine coating. The micro patches allowed creating special quasi-spherical aqueous droplets that are stably attached on surfaces. We found that the cellular spheroids formed on spheroform exhibited superior properties due to the unique quasi-spherical environments. Results showed that the glucose sensitivity of islet cell spheroids was increased by ~ 200%, and secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) from mesenchymal stem cell spheroids was enhanced by up to ~300% than conventional three dimensional cell culture methods. Thus, the specialized sur-face called spheroform can be a new surface platform created by emerging biomimetic chemistry that can be generally applied to stem cell biology and engineering as well as preparation of a variety of therapeutic cellular spheroids. In chapter 5, a mussel-inspired approach for engineering of extracellular matrix for human embryonic stem cell self-renewal was described. For practical applications of human embryonic stem cells (hESCs) in regenerative medicine, hESCs should be cultured on a large scale, and their proliferative property has to be maintained in a controllable manner. Here, we report that heparin is an effective polysaccharide for the feeder-free culture of hESCs. To robustly immobilize heparin on substrates, an adhesive catechol moiety, dopamine, was chemically tethered to the heparin backbone (called HepC). On the HepC-coated substrate, 80 % of hESC colonies robustly adhered and expressed three representative pluripotency markers, OCT4, SOX2 and NANOG. When collagen type I is co-immobilized with HepC, long-term undifferentiated growth of hESC over 18 passages was achieved with 100 % adhesion effiency, whereas hESCs cultured on collagen underwent spontaneous differentiation after 6th passage. We attributed this unprecedented capability of HepC to support such a long-term undifferentiation of hESC to, in part, the binding of vitronectin, one of the important extracellular matrix components. We expect that this study will expand the usage of the polysaccharide heparin from the conventional three-dimensional hydrogel-related applications to two-dimensional coating for stem cell ex vivo expansion. In chapter 6, site-selective conjugation reaction of peptides/proteins via catechol groups for in vitro maintenance of induced pluripotent stem cells was described. Conjugations of pep-tides/proteins with functional polymers have been considered as a powerful strategy for microenvironment engineering because the synergistic effect of functions of both protein/peptide and polymer could be often achieved. When it comes to conjugation reaction of proteins or peptides, the orientation should precisely be controlled because the orientation of peptides/proteins frequently affects the biological activities. Herein, site-selective reaction of catechol with N-terminus amine of peptides/proteins was demonstrated. Taking advantage of both the catechol’s reactivity with primary amines and difference in microenvironment between N-terminus amine and Lysine amine, the author achieved N-terminus amine-selective conjugation of peptides and protein with a catechol-grafted-hyaluronic acid (HA-Cat). Laminin-derived peptide (LDP) and insulin was utilized as a model peptide and protein respectively. N-terminus amine selective conjugation was confirmed via protein mapping by tryptic digestion. For HA-cat-LDP, no fragment containing N-terminus of LDP was detected in RP-HPLC analysis, whereas all digested fragment, even N-terminus-containing fragment were detected for common un-chemoselective reaction using EDC/NHS. In addition, we found that vitronectin-derived peptides were able to be immobilized on polydopamine-coated surfaces, and effectively support undifferentiated growth of human induced pluripotent stem cells (hiPSC).The chemoselective reaction of catechol will be considerably beneficial in various scientific and engineering fields utilizing proteins and peptides. In this thesis, bio-inspired surface functionalization and stem cell microenvironment engineering were investigated using dopamine, a mussel-inspired adhesive molecule. Considering the high biocompatibility and applicability of dopamine toward various polymers and surfaces, the author expects that the mussel-inspired approaches would contribute to the research and the practical use of biological science and regenerative medicine.

도파민은 카테콜기와 아민기로 이루어진 작은 분자로서, 산화 환경에서 스스로 중합반응을 진행하면서 모든 종류의 물질 표면에 코팅된다는 특성이 잘 알려져 있다. 뿐만 아니라, 아민기 또는 티올기와 같은 친핵성 분자와 반응성을 띠기 때문에 코팅 후 표면에 2차 개질이 가능하다. 또한 도파민의 접착성은 도파민이 비접착성 고분자에 컨주게이션되었을 때도 유지되기 때문에, 다양한 기능성 고분자에 접착성을 부여하는 방법으로도 활발히 활용되고 있다. 본 연구에서는 이러한 도파민의 다재다능한 화학적 특성을 활용하여 다양한 표면의 기능화에 관한 연구를 하였고, 나아가 줄기세포의 미세환경을 조절하여 실질적 약물로서의 활용 가능성을 높이는데 적용하였다. 제 1 장 에서는 연구의 배경 및 목적을 간략히 기술하였다. 먼저 도파민의 물리, 화학적 특성 및 다양한 활용을 소개하였고, 줄기세포의 체외 배양시 미세환경 조절의 중요성을 기술하고, 이를 이용한 본 연구의 목적 및 의의를 기술하였다. 제 2 장 에서는 마이크로비드 표면을 폴리도파민으로 개질 후 다양한 물질의 흡착에 관한 연구를 수행하였다. 폴리도파민의 물질의 종류 및 모양에 상관없이 코팅되는 특성을 이용하여 ~50 ?m 크기의 실리카 비드를 코팅하였다. 폴리도파민은 다양한 금속과 배위결합을 통해 상호작용 하는 것으로 알려져있는데, 실제로Cu(II), Cr(VI), Hg(II), Cd(II), Pb(II) 이온을 수용액 상에서 다량 흡착하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 의료용 방사성 동위원소인 177-루테튬에 대해서도 높은 흡착율을 보였으며, 유기분자인 4-Aminopyridine 를 아민기를 통해 상호작용하는 것을 확인하였다. 제 3 장 에서는 마이크로파를 이용하여 카테콜아민류의 코팅 속도를 높이는 연구를 기술하였다. 카테콜아민류의 실질적 활용을 위해서는 느린 코팅 속도를 극복해야 하는데, 본 연구에서는 카테콜아민 용액에 마이크로파를 조사할 경우, 별다른 산화제의 첨가 없이도 코팅 속도가 현저히 증가하여, 15분 안에 ~18 nm의 순수한 폴리도파민 코팅이 형성됨을 발견하였다. 메커니즘 분석 결과, 마이크로파에의한 라디칼 형성 및 가열 효과가 코팅 속도 증진에 크게 기여하는 것으로 나타났다. 제 4 장 에서는 홍합 모방 접근법을 치료용 세포 클러스터 형성 기술에 적용하였다. 세포 클러스터 형성은 실제로는 3차원인 체내 미세환경을 효율적으로 모방하기 때문에 다양한 세포의 기능성 및 생존률을 높이기 위해 적용되어 왔다. 세포클러스터를 효율적으로 만들기 위한 다양한 접근법들이 제시되었는데, 그 중에서도 행잉드랍 (Hanging-drop) 방법은 세포클러스터의 크기를 정확하게 조절 가능한 큰 장점을 갖는다. 본 연구에서는 초소수성 표면에 마이크로 크기의 친수성 폴리도파민 패턴을 도입하여 구형의 물방울을 초소수성 표면 위에 고정할 수 있는 스페로폼 (Spheroform) 이라는 플랫폼을 개발하였다. 스페로폼 위에 물방울을 고정한 후 표면을 뒤집을 경우 기존과 다른 행잉드랍 플랫폼으로 활용 가능하였다. 이러한 방식으로 췌도 세포 클러스터를 배양한 결과, 기존의 행잉 드랍 배양 대비 클러스터 크기가 정확히 조절되었고, 세포의 생존률이 향상 되었다. 또한, 췌도 세포의 인슐린 감응성이 ~200 % 증가함을 관찰하였다. 간엽줄기세포의 경우 스페로폼에서 배양할 경우 혈관내피성장인자의 분비량이 ~300 % 증진되었다. 제 5 장 에서는 인간배아줄기세포의 자기재생을 지지하기 위한 세포외기질 조절에 홍합 모방 접근법을 적용한 연구를 소개하였다. 재생 의학 분야에서 인간배아줄기세포를 실질적으로 임상에 적용하기 위해서는 인간배아줄기세포를 대규모로 배양하는 기술이 수반되어야 한다. 본 연구에서는 기존에 줄기세포 배양용으로는 활발히 연구되지 않은 다당류인 헤파린에 접착성을 부여하여 인간배아줄기세포의 미분화 성장을 장기간 지지할 수 있는 물질을 개발하였다. 헤파린-도파민 코팅 표면에서 인간배아줄기세포를 배양하는 경우 80 % 의 부착률로 콜로니가 표면에 부착하였고, 첫 번째 계대배양에서 대표적 미분화 마커인 OCT4, SOX2, NANOG를 발현하는 것을 확인하였다. 표면 부착률을 높이기 위하여 세포외기질 성분 중 하나인 콜라겐 1을 헤파린-도파민과 함께 코팅하여, 그 표면에서 줄기세포를 배양한 결과, 부착률이 100 %로 증가하였으며, 18번 째 계대배양까지 미분화 성장을 유지하였다. 또한, 장기간의 계대배양 이후에도 정상핵형을 유지하여, 인간배아줄기세포의 장기간, 대량 배양용 물질로서의 가능성을 확인하였다. 제 6 장 에서는 홍합 모방 카테콜 기능기를 이용한 단백질/펩티드의 위치 선택적 반응에 관한 연구를 기술하였다. 단백질/펩티드는 반응 위치에 따라 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 위치 선택적 반응이 매우 중요하다. 카테콜기의 아민에 대한 반응성과 단백질/펩티드의 말단 아민과 리신기 아민간의 미세환경의 차이를 이용하여, 카테콜기 컨주게이션된 히알루론산 (히알루론산-도파민)에 기능성 단백질 또는 펩티드를 말단 아민기를 통해 컨주게이션 하였다. 트립신 분해 반응으로 위치 특이적 반응을 검증하였다. 또한, 폴리도파민 코팅 표면에 비트로넥틴 펩티드를 말단 아민기를 통해 고정화할 경우, 역분화줄기세포의 미분화 성장을 지지하는 것을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구에서는 다양한 생체 모방성 표면 개질을 연구하고, 줄기 세포의 생물학적 미세환경을 조절함으로써 재생의약으로의 적용 가능성을 확인하였다. 특히, 홍합 모방 접근법은 다양한 표면 및 고분자에 적용 가능하고, 생체 적합성이 뛰어나기 때문에 바이오·의약 분야의 연구 및 실용화에 큰 기여를 할 것으로 기대된다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCH 15028
형태사항 xii, 100 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 이미현
지도교수의 영문표기 : Hae Shin Lee
지도교수의 한글표기 : 이해신
수록잡지명 : "Spheroform: Therapeutic Spheroid-Forming Nanotextured Surfaces Inspired by Desert Beetle Physosterna cribripes". Advanced Healthcare Materials, v.4, pp.511-515(2015)
수록잡지명 : "Water Detoxification by a Substrate-Bound Catecholamine Adsorbent". ChemPlusChem, v.77, pp.987-990(2012)
Including Appendix
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 화학과,
서지주기 References : p.
주제 catecholamine
polysaccharide
microenvironment
stem cell
biomimetics
카테콜아민
다당류
미세환경
줄기세포
생체모사
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