Rapid freezing and freeze-drying have been widely used for the storage of bacterial cultures. Substantial degree of cell damage, however, has been accompanied in these methods and the mechanism of cell damage was tried to be explored in this study.
When Lactobacillus lactis cells were frozen for 5 minutes at -196℃ or further dried for 24 hours under vacuum and then incubated in 1.0 % phosphate buffer for 90 minutes at 37℃, a considerable amount of cell materials were observed to be released in the incubation medium which could be detected by the UV-analysis having an optimum absorption at 260 nm.
Among various agents tried, 1.0 % phosphate solution showed the highest leakage of cell materials during the period of incubation. The UV-absorbing materials from the frozen or freeze-dried lactic acid bacteria cells during incubation in the phosphate solution was found to be dependent on PH and temperature having optimum values of 7.2 and 45℃, respectively. Addition of $Mgcl_2$ in the incubation medium at the level of 0.1% inhibited the leakage of the cell materials markedly.
The leaked cell materials were analyzed and found that RNA and protein occupied the major part with negligable amounts of DNA and carbohydrates. And when cells were incubated for a longer period, only RNA continued to release in the incubation medium. It was also found that the addition of cell protecting agents, such as glycerol, dextrose, dimethyl sulfoxide, and 0.1 % $Mgcl_2$ in the suspending solution of the cells during freezing could prevent the leakage of cell materials during the process of the subsequent incubation. It suggested that the protectants could prevent the damage of permeability barrier which might be related to the death of cells. However, no direct relationship between the increasing of the leaked cell materials and the cell viability could be detected.
현재 가장 많이 사용되는 균 보존의 방법은 직접 얼리는 방법과 동결 건조법 (freeze-drying) 이라고 할 수 있다. 이 방법들의 처리시 세포막에 손상을 입혀 세포막의 투과성을 변하게 하므로 세포내에 있던 물질이 주위 용액으로 유출하게 된다.
이 실험에서는 액체질소 에서 급속 냉각한 Lactobacillus lactis를 37℃ 의 인산 완충용액에 90 분간 두었을때 유출되어 나오는 세포내 물질을 자외선 흡광도로 그 양을 측정하고, 또한 화학적 방법으로 그 성분을 조사했다.
완충용액의 온도가 20℃ 이하가 되면 세포내 물질의 유출이 없었고 pH 의 변화에도 큰 영향을 받았다. 그리고 orthophosphate 가 최대의 유출을 나타내는데 꼭 필요한 물질 이었다.
유출되는 세포내 물질 성분의 대부분은 RNA 와 단백질 이었고, DNA 와 탄수화물은 무시할수 있는 양 이었다. 그 총양을 건조 세포 무게와 비교해 보면 세포의 약 14% 가 유출되고 있었다. 이 유출은 incubation 시간을 길게하면 계속 증가 되었으나 $Mg^{++}$ 를 가하면 총 유출되는 양의 감소 뿐만 아니라 더 이상의 incubation 을 하더라도 그 양이 증가하지 못하는것 같았다. 보호제와 함께 얼린 세포는 세포내 물질의 유출이 굉장히 적었고, 이러한 세포들의 생존도로 부터 세포막의 손상에 의한 투과성의 변화와 생존도 와의 어떤 연관성을 약간 볼수 있었다. Incubation 시간을 길게 했을때 자외선 흡광도를 계속해서 증가하게 하는 물질의 대부분은 RNA 인것 같았다.
여러가지 상황에서 볼때 세포내 물질의 유출에는 물리적인 유출 뿐만 아니라 어떤 효소적인 작용에 의한 유출도 하고 있는 것 같다.
