The activation of plasminogen to an active fibrinolytic enzyme plasmin, was studied with urokinase (EC 3.4.99.26). A crude form of urokinase obtained from human urine was purified partially by an ion-exchange column of ECTEOLA and further by an affinity column employing arginine as a ligand on sepharose 4B matrix. The specific activity of final enzyme preparation was about 301.4 units per mg protein based on the caseinolytic assay measuring the rate of casein hydrolysis by plasmin formed. The mode of the enzyme action seems to be similar to that of trypsin in the term of the esterase activity, but the enzyme is found to be very specific towards plasminogen as the substrate. Characteristic properties of the enzyme were studied and compared with that of other proteolytic enzymes of trypsin and plasmin. Therfore, it can be suggested that the nature of these enzymes may be different physiologically. Inhibition study of the enzyme was also carried out with a variable concentration of $Cl^{-}$ STI, 6-aminohexanoic acid and other substrate analogs. Studies on the mechanism of the enzyme action was carried out, in the manner of the effect of pH on kinetic constants and the inhibition by several functional group blocking agents, such as DIFP and diethylpyrocarbonate. These results indicate a possible involvement of hydroxyl group of serine and imidazole group of histidine residues at the active site of urokinase. The similarity of urokinase and other serine-proteases in mechanism is observed.
Urokinase 는 사람의 뇨에 미량 존재하는 효소로 fibrin clot 을 용해시키는 효소인 plasmin 을 그의 전구체인 plasminogen 으로 부터 활성화시키는 작용을 가진다. 뇨중에 존재하는 urokinase 를 정제하기위해 ECTEOLA chromatography 를 사용한 결과 수율은 42% 였고 5.2 배 정제된데 비해 Sepharose 4B - arginine 을 이용한 affinity chromatography 에서는 수율이 92% 였고 56 배 정제되었다.
Urokinase의 활성측정은 urokinase 와 plasminogen 을 coupling 시킨 caseinolytic assay로 행하였다. Urokinase의 기질특이성을 보면 plasminogen에 매우 특이하게 작용하며, 기질유사물질, STI 와 $Cl^{-}$에 의한 저해도 일어났다.
pH 의 속도상수에 미치는 영향을 측정한 결과 PK = 6 ~ 7 사이의 group 즉 hiatidine 의 imidazole group 이 작용함을 추정할 수 있다. 이러한 추정을 보강하기 위해 작용기의 억제작용을 가진 dietylpyrocarbonate 와 DIFP 를 처리한 결과 저해를 받는 것으로 serine 과 histidine 이 활성부위에서 작용하는 것을 알 수 있다.
이러한 사실들로 urokinase 의 작용기전은 trypsin 이나 plasmin 동과 같은 여타의 serine-proteases 와 유사함을 알 수 있으나 기질특이성 GTI 와 $Cl^{-}$ 저해효과등의 상이점으로 urokinase 는 생체내에서 trypsin 이나 plasmin 등과는 다른 기능과 조절작용계를 가진것으로 추정할 수 있다.
