The β-glucosidase (EC.3.2.1.21), a member of cellulolytic enzyme system, was isolated from the culture filtrate of $\underline{Aspergillus}$ $\underline{phoenicis}$ QM 329, and was partially purified by DEAE-cellulose ion-exchange chromatography and by an affinity column employing p-aminophenyl-l-thio-β-D-glucoside as a ligand on Sepharose-4B matrix.
The enzyme partially purified showed a very limited substrate specificity for β-D-glucoside. The Km value for the p-nitrophenyl-β-D-glucoside was 0.75 mM and it showed substrate inhibition above 5 mM with p-nitrophenyl-β-D-glucoside and cellobiose.
The glycone moieties of substrates (e.g. β-D-glucose) were essential for substrate binding and the aglycone moiety had little specificty for enzyme-substrate binding. And the activity of β-glucosidase was optimal at PH 4.5 and 65℃, and energy of activation for p-nitrophenyl-β-D-glucoside was 11.2 Kcal/mole.
Addition of polyols (especially, L-arabitol) to reaction mixture showed increment of p-nitrophenol and decrement of β-D-glucose production with p-nitrophenyl-β-D-glucoside as a substrate. Their kinetic modes were expected from derived equations and transglucosylation product was detected with paper chromatography.
Nojirimycin was a potent inhibitor, of which Ki value was 0.24 μM and hydroxylamine showed mixed type inhibition in acetate buffer or pyridine buffer.
Heavy metals such as $Hg^{++}$ and $Ag^+$ and p-chloromecuribenzoate showed not marked inhibition, but bromosuccinimide showed strong inhibition.
From kinetic analysis of PH-rate studies and carboxyl group modification study, there might be 2 carboxyl groups with $pk_1 = 4.1$ and $pk_2 = 6.1$.
And a new model of β-glucosidase reaction mechanism was proposed.
Cellulase 의 한 성분인 β-glucosidase 를 Aspergillus phoenicis QM 329 의 배양액으로 부터 DEAE-cellulose 이온 교환 크로마토그라피 와 Sephadex G-100 을 이용한 gel-filtration 을 이용해 부분적으로 정제 하였고, p-amino phenyl-l-thio-β-D-glucoside 를 ligand 로 사용한 친화성 크로마토피도 행하였다. 이때 각각 20 배와 28 배 정제 되었다.
정제된 β-glucosidase 는 β-D-glucoside 에 대해서 상당한 기질 특이성을 보였고, PNPG 를 기질로 쓸 경우 Km 값은 0.75 mM 이었고, 이 기질과 cellobiose 모두 5 mM 이상 에서는 기질 저해현상을 보였다. 기질의 glycone 부분인 β-D-glucose 는 효소에 대하여 강한 친화력을 보여 주고 있으며, 다른 aglycone 부분은 기질-효소 결합이 특이성을 보이지 않는 것 같다.
이 효소 반응시 적정 온도와 pH는 65℃ 와 4.5 이었고, 활성화 에너지는 11.2 Kcal/mole 로 계산 되었다. 효소 반응액에 여러가지 polyol 을 (특히 L-arabitol )을 첨가할 경우, p-nitrophenol 생성 증가와 β-D-glucose 생성 감소가 관찰 되었으며, 이들 변화에 대한 반응속도론적 연구로 부터 transglucosylation 반응의 가능성을 예측할수 있었고, 실제 그 transglucosylation 의 반응산물 들을 크로마토그라피 방법으로 확인할수 있었다. Nojirimycin 과 gluconolactone 의 경우 이 효소에 대하여 강력한 저해제로 작용함을 알았으며, Ki 값은 전자에 대하여 0.24μM 이었다.
한편 hydroxylamine 에 의한 효소활성의 저해 실험을 통하여 효소 기질 반응에 공유결합 중간체의 존재 가능성을 제시할수 있었다. 또 $Hg^{++}$ 와 $Ag^+$ 같은 중금속과 PCMB 에 의하여 효소 활성도는 별로 저해되지 않았으나, bromosuccinimide 에 의하여 강력한 저해를 보였다.
