To remove the naringin which is the main bitter principle of grapefruit, naringinase was immobilized on porous glass by covalent bonding and its characteristics were studied.
Crude form of naringinase produced from $\underline{Aspergillus}$ $\underline{niger}$ was partially purified by various methods and immobilized to porous glass beads (96% alkylamine derivative). About 40-70% of initial naringinase activity was recovered after immobilization process. The optimum pH of the immobilized enzyme was the same as that of soluble enzyme; however, immobilized naringinase showed a broader pH - activity profile than that of the soluble enzyme. pH dependence of stability of both was fairly similar up to pH 6.0, but above this pH the immobilized enzyme was more stable than the free enzyme. The optimal temperature shifted from 40℃ to 55℃, and the thermal stability of the immobilized enzyme was better than that of the native naringinase. By immobilization, the activation energy of reaction was markedly decreased from 14.9 to 8.54 (kcal/gmole), and so was the apparent Km value from 2.2 to 0.86 (mM).
Many experimental data in this work demonstrate the fundamental role played by diffusion in determining kinetic properties of immobilized naringinase on glass bead.
The deactivation rate of naringinase can be described by a simple mathematical model derived from first-order deactivation and simple Michaelis Menten kinetics. At optimum conditions of immobilized naringinase (pH 5.0, 55℃), the first-order decay constant was 0.0061 $hr^{-1}$ and the half life about 115 hrs. The activation energy of deactivation reaction was calculated as 2.38 Kcal/gmole. Increasing the reaction temperature results in an increase of the reaction rate, but it will be normally expected to promote the deactivation of the enzyme. Thus we attempted to determine the most economic temperature by computer simulation technique. As a computer simulation result, the decrement of activity caused by thermal deactivation is much smaller than the increment of activity caused by raising the operating temperature, in the case of immobilized naringinase.
밀감쥬스에서 쓴맛을 내는 주성분인 naringin 을 고정화효소를 사용하여 연속적으로 제거하기 위해서, naringinase 를 다공성의 glass bead 에 고정화 시키는 조건과 그 고정화효소의 여러가지 성질들을 검토하였다.
효소는 $\underline{Aspergillus niger}$ 가 생산한 조효소를 부분적으로 정제하여 고정화에 사용하였으며, 이를 다공성 glass bead 의 96 % alkylamine 유도체에 고정화한 결과 효소역가의 수율은 40 - 70 % 이었다.
고정화효소의 최적 pH 는 원래의 효소와 같았으나 pH 변화에 대해서는 매우 둔감하였다. pH 안정성은 pH 6.0 까지는 원래의 효소와 변함이 없었으나 그 이상의 염기성 용액에서는 더 안정하였다.
최적온도는 수용성효소가 40℃ 인 반면에 고정화효소는 55℃ 이었으며 열에 대한 안정성은 고정화효소가 비교할 수 없을 정도로 좋았다.
Naringinase 를 고정화시킴으로서 효소반응의 활성화 energy 는 14.9 Kcal/mole 에서 8.54 Kcal/mole 로 현저하게 감소하였으며, 겉보기 Km 값도 2.2 mM 에서 0.86 mM 로 감소하였다.
유속에 대한 반응속도의 변화를 관찰해 본 결과 고정화효소의 반응 속도는 glass bead 내에서의 기질과 생성물의 물질 전달속도의 영향을 받고 있음을 알 수 있었다.
효소활성의 감퇴반응을 고찰해 본 결과 효소 활성의 감퇴현상은 단순한 일차반응을 따르며, 이 고정화 naringinase 의 최적조건 (pH 5.0, 55℃)에서의 감퇴상수는 $0.0061 hr^{-1}$ 이었고 활성반감기는 115 시간 정도임을 알 수 있었다. 또 효소활성의 감퇴반응에서의 활성화 energy 는 2.38 Kcal/mole 이었다.
일반적으로 반응의 온도를 올려주면 반응속도는 함께 증가하지만 이와 더불어 효소활성도 더 빨리 감퇴되므로 온도를 계속하여 올려주는 것은 오히려 비 경제적이다. 가장 경제적인 온도를 구하기 위해서 computer 를 사용하여 simulation 해 보았다. 그 결과, 고정화 naringinase 의 경우, 온도를 올려줌으로써 증가되는 효소활성의 감퇴 속도는 온도를 올려줌으로써 증가한 효소의 반응속도에 비해 매우 낮았다.
