α-D-Galactosidase (E.C. 3.2.1.22) of pig liver was purified by ammonium sulfate fractionation, DEAE-cellulose and Sephadex G-200 column chromatography. With these steps of purification the enzyme was purified about 70-fold over the crude enzyme showing specific activity of 106.6 units per mg of protein.
The partially purified α-galactosidase showed the maximum activity at pH 3.5, and the temperature at 50℃. And the Na-citrate buffer at 50 mM concentration was demonstrated as the best buffer system. The enzyme exhibited maximum stability at pH 5.0-6.0 and deactivated completely within 2 hours at 60℃.
The kinetic constants, i.e., $K_m$ and $V_{max}$ of this enzyme using PNPG as substrate was 1.37 mM and 14.71 nmoles per minute, respectively. Both α-D-galactose and melibiose exhibited competitive inhibition mode. Among the various metal ions, $Ag^+$ and $Hg^{2+}$ showed strong inhibition on enzyme activity.
The observation of the effect of pH on $K_m$ and $V_{max}$ indicates that the carboxyl and histidine group may be involved in the active site of the enzyme. The inhibition of the enzyme by photooxidation again supports the participation of histidine group in the active site.
Considering the above results, a two-step mechanism was postulated for the action of pig liver α-D-galactosidase. Here the aglycone is cleaved by the concerted action of carboxyl and imidazolium groups. This is followed by reaction with an acceptor molecule (R`OH), which may be water or an aliphatic alcohol, resulting in hydrolysis or transfer products.
α-Galactosidase(E.C.3.2.1.22)는 식물계 뿐만 아니라 인간을 포함한 여러 동물조직에서 다당류 및 glycolipid 의 대사 작용에 중요한 생리적 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져있다.
본 실험에서는 비교적 그 특성이 잘 알려져 있지 않는 돼지 간으로 부터 효소를 추출하여 DEAE - cellulose 및 Sephadex G-200 column chromatography 에 의해 부분적으로 정제한뒤 그 일반적 성질 및 반응 기전을 알아보았다. 부분적 정제된 효소는 추출시의 crude 효소에 비해 그 비활성도가 약 70배나 증가 되었다.
이 효소의 일반적 특성을 살펴보면 최적 pH 는 3.5였고 최적 온도는 50℃ 였다. 또한 효소의 안정성은 pH 5.0에서 가장 좋았고 40℃ 에서 10시간 동안 안정함을 보여주었다.
한편 p-nitrophenyl-α-D-galactoside 를 기질로 사용 했을때 Km 값은 1.37 mM 이었고 Ag+ ion 과 Hg++ 이온이 효소 활성에 큰 저해를 주었다. 기질유사체인 melibiose 와 raffinose에 의해서 경쟁적 저해를 받았다. 효소와 효소 - 기질 복합체에 대한 이온화 상수를 계산해 본 결과 pKa 3.0-3.2, pKb 5.0-6.0으로 나타났다. 또한 photooxidation 에 의해서 저해를 받는 것으로 나타났다.
이러한 결과들로 미루어 효소의 활성부위에는 carboxyl 기와 histidine 기가 있을것으로 추정하여 다음과 같은 반응 기전을 제시했다. 즉 deprotonate 된 carboxyl 기와 protonate된 imidazolium 기의 concerted action 에 의해서 C-1 위치의 비당체 부위가 끊어지고 물이나 aliphatic alcohol 인 R'OH 가 수용체 분자로 작용하여 가수분해 산물 혹은 전이생성물이 생길것으로 추정된다.
