Tyrosinase (monophenol, dihydroxyphenilalanine: oxygen oxidoreductase, E. C. No. 1. 14. 18. 1) is a copper containing mixed-function oxygenase catalyzing the o-hydroxylation of monophenols and the oxidation of o-diphenols to o-quinones. The enzyme was induced by addition of cyclohexiimide in $\mbox{\underline{N}}$. $\mbox{\underline{crassa}}$ cultures. The enzyme was purified about 500-fold by following steps, that is, 60% ammonium sulfate fractionation, Celite and DEAE-Sephadex (A-50) chromatography to give a specific activity of 260.4 units per mg protein and an overall recovery of 28%.
The enzyme seems to attack various monophenols and diphenols and the substituent groups on phenols appear to affect profoundly the binding and the reactivity of the enzyme. The kinetic constants for these compounds were calculated to be about $10^{-3}-10^{-4}$ M. Among the tested substrate analogues, 4-tert-butylcatechol was found to be the best substrate. From the studies on the effect of varing pH and temperature, the activity of the enzyme was found to be optimum at pH 7.0 and 40 ℃. The cresolase activity of the enzyme showed rather long (3-4 min.) lag period, which was disappeared upon the addition of trace amount of DL-DOPA ($1 × 10^{-5}$ M). Other reductants, such as ascorbate, ferrocyanide, reduced PMS and cytochrome c, had no effect on the lag.
In the initial rate experiments, a series of convergent lines was obtained in double reciprocal plots, which suggests the formation of ternary complex in the enzyme action. The enzyme was severely inhibited by copper chelating agents, such as DDC or cyanide, and by thiols, like 2-mercaptoethanol. But, SH-blocking agents did not inhibit the enzyme activity. The kinetic patterns of inhibition by PABA and cyanide in both activities provided some indications that there are two binding sites for phenolic substrates. And, from the experiment of photooxidation of holo- and apoenzyme, it can be suggested that histidine may involve as a ligand of copper in the enzyme active site.
On the basis of a limited amounts of information accumulated, a plausible reaction scheme for this enzyme action was proposed and discussed.
$\mbox{$\underline{Neurospora crassa}}$로 부터 cyclohexiimide 를 사용하여 tyrosinase 를 유도 생산케 한뒤, 이를 60% 황산암모늄 분별, Celite 와 DEAE-Sephadex (A-50) chromatography 에 의해 분리, 정제 하였고, 그의 특이한 성질들, 즉, 기질특이성, 수산기 첨가반응에서의 지연현상과 여러 반응억제물질에 대한 민감도등에 의해 동정되었다.
이 효소는 수산기 첨가 반응과 탈수소화 반응을 촉매하는 Cu를 포함한 효소로서 많은 종류의 monophenol 과 diphenol 을 공격하는 것으로 보였으며, 이들 기질에 대한 속도상수를 구하였는바, 4-tert-butylcatechol 이 시험한 물질중에서 가장 좋은 기질인 것으로 밝혀졌으며, 치환기에 따라 반응이 심하게 영향을 받는것으로 밝혀졌다. 최적온도와 최적 pH 는 각각 40 ℃ 와 pH 7.0인 것으로 나타났으며, 활성화 에너지는 10.3 Kcal/mole, 변성에너지는 -42.7 Kcal/mole 이었다.
초기 반응속도에 대한 실험에서는 Lineweaver-Burk plot 으로부터 일련의 수렴하는 직선들을 얻었는데, 이는 효소반응에서 ternary - complex 가 형성됨을 시사한다고 본다. pH 변화에 따른 반응속도 상수의 변화에 관한 연구에서, 이 효소의 pKa 값은 4.4-4.5. pKb 값은 9.0-9.1 인 것으로 나타났다.
이 효소는 PCMB 와 같은 SH-blocking agents에 의해서는 영향을 받지 않았으며, DDC 나 시안 이온과 같은 Cu 와 결합하여 제거하는 물질에 의해서는 심하게 그 활성이 억제되었으며, 2 - mercaptoethanol 과 같이 -SH 기를 가진 물질들도 같은 결과를 보였다. 한편으로, PABA 와 시안 이온의 효소작용에 대한 inhibition pattern은 효소의 활성부위 내에 phenol 류 기질에 대해 두 개의 결합부위가 있음을 시사하고 있으며, photooxidation 의 결과로부터는 Cu 의 ligand 가 histidine일 것으로 밝혀졌다.
이상의 결과와 종전의 실험결과들을 토대로 가능한 반응모델을 제시하였는 바, 이의 기본 개념은 이 효소가 기질인 diphenol 에 의해 환원, 활성화 되고 $O_2$ 에 의해 다시 산화되는 catalytic cycle을 이룬다는 것이다.
