Sulfhydryl oxidase (EC 1.8.3.2) was purified partially by Sephadex G-100 and DEAE -cellulose column chromatography and more characterized from bovine skim milk. The enzyme was purified about 1800 fold over the skim milk and showed optimum pH at 7.2 and optimum temperature at 37℃. The activation energy of the enzyme was calculated to be 13.8 Kcal/mole by the Arrhenius equation. The molecular weight of the enzyme was verified to be 87,000 using Sephadex G-200 column chromatography. And it was confirmed that the enzyme acted on the conversion of sulfhydryl groups to their corresponding disulfides. This enzyme was inhibited by the addition of metal chelator, EDTA, but not by o-Phenanthroline,α,α -Dipyridyl which are iron specific chelators. And this enzyme requires $Mn^{++}$ for its activity. The application of functional group blocking agents and the photooxidation didn't show the involvement of imidazole or hydroxyl groups in the active site of the enzyme. The enzyme obeyed Michaelis-Menten type kinetics at the low substrate concentrations but at the high substrate concentration above 0.83mM of GSH, substrate inhibition was observed. The Km and Vmax values were calculated to be 1.0×$10^{-4}$ M and 4.0 units per milligram protein, respectively. And this enzyme showed broad substrate specificity for thiol compounds bearing over two functional groups. Plots of $1/v_o$ vs. 1/(cyst.) at various concentrations of fixed substrate $O_2$ showed uncompetitive type. And this enzyme was not inhibited by a product, disulfides, under saturated $O_2$ concentration. These results represent that the complex of enzyme-substrate, from which disulfides depart, leaving hydrogenated enzyme. Oxygen then combines with the hydrogenated enzyme to give the complex of two, which decomposes to yield the product $H_2O_2$ and free enzyme.
Bovine skim milk 로 부터의 sulfhydryl oxidase (E.C. 1.8.3.2) 를 전통적인 방법인 Sephadex G - 100 과 DEAE - cellulose 를 사용하여 부분정제 하였다. 이때 이 효소는 skim milk 로 부터 최종단계까지 약 1800배 정제 되었으며 일반적 특성으로 pH 7.2, 37℃ 에서 최적 조건을 나타내었으며, 효소에 대한 온도의 영향을 Arrhenius 식을 이용해 13.8 Kcal/mole의 효소 활성화 에너지를 얻었다. 이 효소의 분자량은 Sephadex G -200 colum 을 통과시켜 87,000으로 추정되었으며 이 효소는 sulfhydryl group 을 그에 대응하는 disulfide 로 전환시키는데 작용한다는 것을 직접적으로 확인할 수 있었다. 또한 이 효소는 철 이온에 작용하는 chelator 에 영향을 받지 않았고 EDTA 처리에 의해 완전히 불 활성화 되었다. 이때 $Mn^{++}$ 에 의해 원매의 활성도를 되찾아 이 효소는 $Mn^{++}$ - dependent 효소임을 알 수 있었다. 이 효소는 active site 에 imidazole 이나 -OH을 가지지 않으며 GSH 를 기질로 하여 기질 농도에 대한 효소 활성도를 조사 했을 때 낮은 농도에서는 Michaelis-Menten Kinetics에 따르나 0.83 mM 이상에서 기질저해 작용을 보여주었다. 그리고 GSH 에 대한 Km, Vmax 값은 각각 1.0×$10^{-4}M$, 4.0 units/mg prot. 으로 나타 났으며 이 효소는 2개 이상의 작용기를 갖는 thiol 화합물에 작용한다는 것이 밝혀졌다. 그리고 2개의 기질중 하나를 고정시키고 다른 한기질의 농도에 따라 double-reciprocal plot 했을때 고정된 기질의 변화에 따라 uncompetitive type 으로 나타났으며 이 효소는 disulfide에 의해 활성도가 저해 되지 않아, 먼저 효소에 RSH 가 들어가 disulfide 로 되어 나오며 여기에 $O_2$ 가 들어가 $H_2O_2$ 로 되어 나오는 간단한 효소 기작을 제시 할 수 있었다.
