A microorganism belonging to Pseudomonadaceae was screened from soil. The pyrocatechase was partially purified by ammonium sulfate fractionation, ion-exchange chromatography, and gel-filtration. The final yield was 12% with the specific activity of 5 μ mole per min per mg-protein.
The results of the general characterization were in general in accord with those from other isofunctional enzymes. It was active between pH 7 and pH 10. The optimum temperature was 35℃. The Arrhenius activation energy was 12.6 kcal per mole. The enzyme was stablest at pH 9. But it lost part of its activity rapidly for the initial 30 hours resulting in 60% of residual activity in 10 days. The molecular weight was found to be less than $7\times10^4$ by Sephadex G-75 chromatography. The Michaelis parameter, Km was 1.9 μM for catechol. The Lineweaver-Burk plot showed noncompetitive pattern when the oxygen concentration was varied below saturation.
The enzyme was seriously inhibited by heavy metals and sulfhydryl agents. PCMB showed strong inhibition immediately while DTNB did only after incubation for 12 hours. The activity was partially restored by the addition of glutathione. The metal chelating agents for divalent ions such as o-phenanthroline or a,a' -dipyridyl were ineffective together with that for trivalent ion, Tiron.
By studying the effect of pH on the kinetic parameters, and from the experiment of photooxidation it was supposed that the imidazole group may participate in the catalysis.
The evolution of the gene for pyrocatechase was discussed on the basis of the comparison of the isofunctional enzymes from diverse microorganisms.
Finally, in addition to the presently known mechanism, a more concrete and probable mechanism involving the imidazole group as a catalytic group at the enzyme active site was proposed. The imidazole group forms a hydrogen bond with hydroxyl oxygen of catechol. A partial positive charge is developped on the carbon atom bearing the hydroxyl group. The negatively charged superoxide ion readily attack the carbon atom resulting in an epoxide derivative of catechol. It leads to product by rearrangement.
Pyrocatechase 는 catechol 의 ortho 위치의 두 수산기 사이의 방향족 고리를 끊어 사슬형 muconic acid 로 만드는 효소다.
효소원으로는 토양에서 분리 채취한 미생물을 사용하였으며 그것은 pseudomonadaceae 에 속하는 박테리아로 확인되었다.
이온 교환 수지와 Gel - Filtration에 의해 부분적으로 정제된 효소는 catechol 을 기질로 사용하였을 경우에 비 활성도가 0.5 unit per mg - protein 이었고 비교적 순수한 상태로 얻어졌다.
효소활성의 최적 pH 는 7 에서 10 사이였고 최적 온도는 35℃ 에서 40℃ 였다. pH 에 따른 안정성을 조사한 결과 pH 9에서 가장 안정하였고 10일후에 약 60%의 활성이 남아 있었다.
기질인 catechol 에 대한 Km 값은 1.9 μM 이었다. 또 이 효소반응이 산화적분해 반응이므로 산소를 포화 시킨 때와 불포화시킨 때에 대해 Lineweaver - Burk plot 을 한 결과 두 경우는 non -competitive pattern 을 나타 내었다. 따라서 이 효소반응은 산소와 catechol 이 효소분자와 더불어 ternary complex 를 이루어 진행되는 것으로 생각되었다.
기질 특이성에 있어서 이 효소는 ortho 위치에 두 개의 수산기가 있을 경우에만 complex 를 형성하는 것으로 나타났다.
수소이온 농도가 Michaelis Parameter 에 미치는 영향을 살핀 결과 imidazole 기가 촉매반응에 관여한다고 생각되었고 이것은 photooxidation 실험에 의해 입증되었다. 이 효소는 중금속 이온이나 sulfhydryl group blocking agent 이 의해서 심하게 활성이 상실되었다. 다른 보고에 의하면 삼가 금속이온에 작용하는 Tiron 이 활성을 저해한다고 하였으나 본 실험에서는 유의성있는 저해현상을 볼 수 없었다.
이상에서 얻은 실험결과는 보고된 다른 pyrocatechase 들의 성질과 비교 되었으며 그 진화적 측면이 논의 되었다. 최종적으로 imidazole 기가 참여하는 좀 더 구체적인 반응기전이 제시 되었는데 여기서는 epoxide 형태의 중간 생성물을 가정하였다.
