By utilizing whole cell enzyme of the $\mbox{\underline{Xanthomonas}}$ $\mbox{\underline{citri}}$ IFO 3835, cephalexin is synthesized directly from 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) and phenylglycine methylester (PGM). To date, cephalexin has been menufactured by chemical process involving fairly large number of steps to protect the amino group of phenylglycine and carboxyl group of 7-ADCA. However, the enzymatic process involves only a single step with 95% conversion within 2hr.
The studies on fermentation variables indicate that oxygen transfer is the limiting step both in the microbial growth and enzyme production. Penicillin acylase inducer failed to induce the enzyme production, and this enzyme is not considered as the penicillin acylase. Optimum conditions for the cephalexin synthesis was elucidated; 37℃, pH6.0, and the optimum mole ratio of PGM to 7-ADCA was 3.
8.63 Kcal per mole of activation energy, 4.0 mM of Km for 7-ADCA, and 12.0 mM of Km for PGM were estimated from experimental results. At a high concentration of substrates, 7-ADCA activates the synthesis but PGM inhibits; the inhibition constant of PGM, Ki, was 70 mM.
From the evaluation of enzyme kinetics, the mode of enzyme action appears to be the partial, rapid equilibrium ordered bi-bi reaction in which an activator, 7-ADCA, and a substrate, PGM, combine with the enzyme in an obligate order; PGM can add only to the enzyme 7-ADCA complex.
The particular decay pattern of whole cell enzyme shows the temporary increase of original activity up to 200% followed by rapid decrease. Enzyme loading effect was also evaluated. The more enzyme loading was introduced, the greater maximum velocity was observed. But the maximum conversion ratio was remarkably decreased, about two thirds of the maximum conversion.
Xanthomonas citri IFO 3835 의 균체효소를 사용하여 cephalexin 의 합성에 필요한 제반인자들에 대해 연구 하였다. 즉 균체의 발효조건, 얻어진 균체효소를 이용한 cephalexin 합성의 최적조건, 그리고 균체효소의 Kinetics 등을 연구 하였다. Xanthomonas citri IFO 3835 는 배양시 많은량의 aeration 이 필요 하였으며 penicillin acylase inducer 로 알려진 phenyl acetic acid와 benzoic acid 는 영향이 없었다. 이 미생물을 28℃, 300rpm 으로 500 ml 진탕 플라스크에서 진탕배양 하였을때 16 - 20 시간만에 미생물 생장이 최고점에 달했으며 효소역가도 이때가 가장 높았다. 이때의 미생물 건조 균체량은 배양액 ml 당 4.4 mg 이었고 세팔렉신 합성능은 배양액 ml 당 2.2 μmoles/min 이었다.
cephalexin 합성 최적조건은 pH 6.0, 37℃ 였고 기질 몰 농도비의 최적조건은 PGM:ADCA 가 3:1 일때였다. 합성반응시에 가해주는 효소량의 변화에 따른 cephalexin 합성수율의 변화를 관찰 함으로써 얼마 만큼의 효소량이 필요한지 알수있었다. 이상과 같은 최적조건 하에서 2시간내에 약 95%의 수율로 cephalexin 이 생성되었으며 그때의 cephalexin 농도는 43 mM 이었다.
7 - ADCA 에 대한 Km 값은 약 4.0 mM였으며 PGM 에 대한 Km 값은 12.0 mM 였다. 일정과량의 7-ADCA 에 의해서는 효소의 활성화가 나타났으나 PGM 에 의해서는 저해가 일어났으며 그때의 기질저해 상수는 70 mM 였다. Kinetic data 를 분석 결과 cephalexin 합성반응에 관여하는 효소의 반응 기작은 급속한 평형 반응으로서 일정한 순서로 기질이 효소와 반응하는것으로 사료 된다. 즉, 7-ADCA 가 효소와 작용하여 효소-7ㆍADCA 의 복합체를 형성한후 활성화 되어 PGM 과 결합하는것 같다.
