Urokinase, from human urine, has the ability to catalyze the activation of plasminogen to plasmin.
Urokinase was purified by conventional method and affinity chromatography. Adsorbents used in affinity chromatography were Sepharose derivatives which contained substrate analogues, lysine, arginine and agmatine as ligands. Of these, agmatine adsorbent attached covalently to Sepharose 4B-ε-aminocaproic acid was effective and urokinase purified by using this column had a specific activity of 466.5 units per mg protein, which is considerably higher than that obtained by conventional method, DEAE-Cellulose and Sephadex G-100 column chromatography. Recovery of affinity chromatography was 90%, but that of conventional method was only 20%.
The general characteristics was also shown; optimum pH, 7.5-8.0, optimum temperature, 30℃, molecular weight, 31,000, and 58,000, and effect of several metal ions, $Zn^{++}$, $Hg^+$, and $Fe^{+++}$ showed the strong inhibition of esterase activity of urokinase, but the inhibition of $Mg^{++}$, $Cu^{++}$, $Na^+$ and $K^+$ were negligible.
By studying the inhibition mode of substrate analogues, it was known that esterase activity of urokinase has broad specificity. The enzyme affinity to plasminogen as a native substrate, was about 3 times, higher than that to the artificial substrate, CT. With regard to the proteolytic activity, UK, plasmin and trypsin showed a very close relationship, but they can be differentiated by their specific inhibition of ε-ACA and soybean trypsin inhibitor. Therefore, it can be suggested that the nature of three enzymes may be different physiologically.
Studies on the mechanism of the enzyme action was carried out. Vm, Vm/Km and Km plotting against pH indicated that pKa and pKb values of the ionizing groups which were essential in the free enzyme were 6.7-6.8 and 8.9-9.0, and that in the intermediate pKa' was 6.4-6.5. These pK values obtained may suggest that a histidine imidazole group will possibly be involved at the catalytic site of urokinase. Inhibition studies with several functional blocking agents such as N-ethylmaleimide, p-chloromercuribenzoate, diiodopropylfluorophosphate and photo-oxidation also indicate a possible involvement of serine and histidine residues at the active site of urokinase.
사람의 뇨중에 미량 존재하는 Urokinase 는 혈장중에 존재하는 Plasminogen 을 Plasmin 으로 활성화 시키며 이때 생긴 Plasmin은 Fibrin 에 의한 혈전을 용해하는 작용을 한다.
Urokinase 는 임상적으로 혈전증 치료에 사용하고 이밖에 암세포 주위에서 일어나기 쉬운 혈액 응고 현상을 제거하므로 약물 침투를 용이하게 하기 위해서 암 치료제와 병용하여 사용한다.
Urokinase 는 Plasminogen Activation Activity 이외에도 Esterase Activity 가 있는 것을 이용하여 기질로써 CTN 을 사용하여 본 실험에서 여러가지 연구가 이루어졌다.
뇨중에 소량 존재하는 Urokinase 를 정제하기 위하여 DEAE-Cellulose와 Sephadex G-100 Chromatography 를 사용한 결과 수율은 20% 이었고 약 8배 정도 정제된데 비해 Sepharose -ε- Aminocaproyl-Agmatine을 Affinity Column 으로 이용하여 정제 하였을때는 수율이 90% 이고 약 14배 정도 정제가 되었다. 이 두가지 방법을 비교해 볼때 Affinity Chromatography 가 간단하고 한단계에 의해 높은 수율을 얻을 수 있는 좋은 정제방법으로 더욱 좋은 Adsorbent 를 개발하면 산업적으로도 유용한 정제 방법이 될수 있다고 생각된다.
Urokinase 의 일방적 성질을 살펴보면 최적 PH 가 7.5-8.0 이고 최적 온도가 30℃ 정도였으며 효소는 매우 안정함을 알수 있었다.
분자량은 31,000 과 58,000 의 2 가지가 있으나 58,000 의 분자량을 가진 효소가 생체내에서 완전한 형태라 할수 있겠다.
합성 저해제로써 ε-ACA 가 Urokinase 에 경쟁적 저해제로 작용함을 알수 있고 이것은 Urokinase 의 활성 부위가 ε-ACA 의 Hydrophobic 한 성질 때문에 저해되어 Plasminogen 활성화를 억제 한다고 할 수 있겠다.
Urokinase 가 일반적인 Proteolytic Euzyme 과 비슷한 성질을 가지고 있음이 보고되어 왔는데 이것은 Trypsin 과 Plasmin 과 같이 여러가지 기질 특이성과 Plasminogen 활성화를 살펴 봄으로써 Urokinase만이 Plasminogen 에 특이하게 작용하여 활성화 시킴을 알수 있었다.
효소나 효소 기질의 복합체에 대한 이온화 상수는 각각 $PK_a$ 6.7-6.8, $PK_b$ 8.9 였고 이것은 Histidine 의 Imidazole Group 이 효소의 활성부위에 관여하는 것으로 추정된다. 이것을 확실히 하기 위해서 Photo-Oxidation 한결과 저해 효과가 큰것으로 보아 Histidine이 작용함을 확인할 수 있었다. 이밖에 아주 저농도의 DIFP 에 의해 저해가 일어나는것으로 보아 Serine 의 Hydroxyl Group 이 활성부위에서 작용함을 알수 있다. 그러므로 Urokinase 는 다른 Serine Proteloytic 효소와 마찬가지로 Serine 과 Histidine 이 활성부위에 관여하여 Acyl-Enzyme Intermediate 를 거쳐 촉매작용을 한다는 기전을 가정할 수 있다.
