As a basic research for the continuous glucose isomerization reactor kinetics, batch kinetics have been studied primarily.
Glucose-isomerase in the form of whole-cell-enzyme has been prepared using a strain of $\mbox{\underline{Streptomyces}$ $\mbox{\underline{phaeochromogenes}$. The stability of the enzyme during storage in 0.05M phosphate buffer solution (PH 7.02) at 5℃ was investigated. The activity decay constant of the enzyme was found to be 0.0017 $hr^{-1}$ under the given storage conditions.
It was proved that the glucose isomerization reaction follows the Reversible One Substrate Enzyme Reaction Kinetics. The Michaelis-Menten constants were found to be 0.238M for forward reaction and 0.490M for reverse reaction. The maximum reaction rates of forward and reverse reaction were 8.75 and 13.2m mole/ 1/min respectively when the enzyme loading was 2,760IU per liter of reaction solution. The equilibrium constant of the reaction was found to be 1.36 and the reaction conditions used were 70±0.5℃ and PH 6.8±0.2 throughout the work.
The kinetic constants were compared with those of other workers$^{20,22}$ and the specific activity of the enzyme were also compared. For the purpose of comparing the data on the specific activity, we have adopted the International Unit system. The specific activity of this enzyme, i. e. 0.23 unit/mg of dey cell weight, was found to be good and it was generally accepted that the affinity of this enzyme to substrate is greater than that to product at a relatively high reaction temperature, i. e. 60℃ or more.
Using the kinetic model it was possible to estimate the reaction time required to achieve 99.9% of equilibrium conversion for each reaction under arbitrary substrate concentration and enzyme loading. The kinetic property of the model was compared with the general Michaelis-Menten type equation.
Based upon the batch kinetics, a continuous tubular-type reactor was designed and a mathematical model for the continuous enzyme reactor was developed. Using the mathematical model, the performance of the reactor was simulated in order to find out general concentration profile and the change in reaction rate along a flow-path of the tubular reactor.
Furthermore, it was possible to predict the optimal operating conditions in terms of productivity, assuming that the maximum allowable space time would be 3 hours and the minimum conversion achieved be 40%. The region of optional operating conditions was found to be in the vicinity of 2.3M for initial substrate concentration and 3 hours for space time when the enzyme loading was 5020 IU per liter of reactor volume. It was also found that the productivity decreases with the space time though the conversion increases.
The continuous reactor was operated and its performance was observed. The experimental results were compared with the simulation results. It was found that the experimental results were in good agreement with the proposed mathematical model in terms of productivity.
Since it was normally expected that the enzyme activity would decrease during prolonged reaction at such a high reaction temperature, 70℃, a prolonged reactor operation was conducted to determine the half-life of the enzyme. Comparison of expermental results with simulation results in terms of steady-state conversion resulted in that the desired half-life was about 94 hours, and that the steady-state conversion achieved by half-deactivated enzyme, i. e. 25.8%, was higher than a half of the conversion achieved by fresh enzyme, i. e. 41.4%.
The latter phenomenon was regarded as an important information concerned with the re-usability of continuous use of the enzyme. The activity decay constant of the enzyme in working enzyme reactor was found to be 0.0073$hr^{-1}$. From the comparison of the two decay constants, it was known that the enzyme activity was more strongly influenced due to the prolonged reaction at such a high temperature than due to the storage.
Using all data obtained a test run was made with the aid of computer under specified operating parameters and performances of three types of reactor-that is, batch reactor, plug-flow reactor(PFR) and continuous stirred tank reactor (CSTR)- were compared in terms of productivity.
As was expected, the performances of batch reactor and PFR were the same, but that of CSTR was worse than PFR.
To provide, the more meaningful guide line, for industrial purpose, changes in the optimal operating conditions were also investigated with changes in the enzyme loading factor in a given reactor.
Thus, all these were done as part of our endeavor optimize the operating variables involved in the continuous glucose-isomerase reactor system.
연속 효소 반응기의 반응 속도론을 연구하기 위한 기초작업으로 회분식 반응기에서의 반응 속도론을 먼저 연구하였다.
Streptomyces phaeochromogenes 균주의 포도당 이성화 전효소를 준비하였다. 이 효소를$5℃의 인산 완충 용액속에 저장하였을 때의 활성감퇴상수는 $0.0017 hr^{-1}$ 임을 알았다.
일련의 회분식 반응기에서의 연구 결과 이 효소 반응은 Reversible One Substrate Enzyme Reaction Kinetics를 따름이 밝혀졌다. Michaelis-Menten 상수는 정반응시에 0.238 M이고 역반응시에는 0.490 M이며, 효소 부하가 2.760IU/l 일때의 최대 반응속도는 정반응시에 8.75 m mole/ℓ/\min 이었고 역반응시에는 13.2 m mole/ℓ/min 이었다. 이 때의 반응 조건은 온도가 70 ± 0.5℃이고 pH는 6.8 ± 0.2이었으며, 평형상수는 1.36이 됨을 알았다.
반응 속도 상수들 및 이 효소의 단위활성을 다른 연구자들의 수치와 비교해 보았으며, 비교의 편리상 단위활성에 관한 수치들은 전부 국제단위 (International Unit) 를 사용하였다. 그 결과 60℃ 이상의 반응 온도에서는 이 효소의 포도당에 대한 친화력이 과당에 대한 친화력보다 더 크다는 것을 알 수 있었고, 전 효소의 겉보기 Km(apparent Km) 값들은 정제된 효소의 값들보다 크다는 것을 확인하였다. 그리고 이 균주의 포도당 이성화 전효소 역가는 1mg의 건조 균체당 0.23 unit으로써 산업적으로 충분히 이용될 수 있는 값임을 알았다.
위에서 구한 속도식을 사용하여 임의의 초기 기질 농도와 효소부하를 가진 회분식 반응기에서의 정반응 혹은 역반응에 대해서, 그 전화율이 평형의 99.9%에 도달할 때까지 걸리는 반응시간을 추정할 수 있었으며, Michaelis-Menten식과의 정성적인 비교도 해 보았다.
상기 반응 속도론에 근거하여 연속식 관형반응기를 설계하고 이것에 적합한 수학적 모형을 유도하였다.
이 수학적 모형을 사용하여 연속식 관형반응기에서의 생성물 (과당) 농도 변화와 반응 속도의 변화를 알아보는 시뮤레이션을 하였다. 나아가서 반응액이 반응기 내에서 체류할 수 있는 최대 허용 한계 시간이 3시간이고 반응기 유출 용액중의 포도당의 전화율이 최소 40%가 되어야 한다고 가정하고, 과당 생성율을 극대화시키기 위한 최적 운전조건을 예견하였다. 그 조건은 반응기 용적 ℓ당 효소 충진량이 5,020IU일 때에, 체류 시간이 3시간이면서 초기의 포도당 농도가 2.3M의 부근인 것으로 나타났다. 또한 포도당의 전화율은 기질의 반응기 내에서의 체류시간이 커짐에 따라 커지나 총 과당 생성율은 오히려 감소함을 알았다.
한편으로 상기 연속식 반응기를 운전하고 그 성능을 관찰하였다. 이 실험 결과를 시뮤레이션 결과와 비교해본 결과 서로 일치하였으며 유도된 수학적 모형은 이 효소 반응기에 잘 맞는다는 것이 입증되었다.
대개 효소는 고온에서의 계속적인 반응으로 인하여 활성을 점차 잃게 되므로, 이 효소에 대해서도 상기 연속식 반응기를 약 5일간 계속 운전하여 활성의 반감기를 알아 보았으며, 그 결과는 약 94시간이었다. 여기서 한 가지 재미있는 발견은 반감기에서의 효소가 달성할 수 있는 정상 상태 (steady-state) 전화율은 주어진 조건하에서 25.8%로, 새 효소 (fresh enzyme)가 달성할 수 있는 41.4%의 반보다도 더 컸다는 사실이었다. 이는 가역반응에 있어서의 독특한 현상으로써, 이 효소를 재사용하거나 또는 계속적으로 사용할 때에 주어진 전화율을 달성시키기 위한 경제적 방편의 수립에 중요한 의미를 가질 수 있다. 그리고 저장시의 활성감퇴상수가 $0.0017 hr^{-1}$인데 비하여 계속적인 반응시는 4배가 조금 넘는 $0.0073 hr^{-1}$임을 알았다.
이상의 data를 종합하여 임의의 운전 매개 변수 - 즉 초기의 포도당 농도, 반응기 내의 기질의 체류시간 및 반응기의 체적 등을 가지고 임의의 저장 시간을 가진 효소를 충진시킨 연속식관형 반응기를 시뮤레이션 기법에 의하여 시험 조작하고, 운전 시간에 따르는 전화율의 변화 및 과당 생성율을 관찰하였다. 그리고 회분식 반응기, 연속식 관형반응기 및 연속식 탱크 반응기의 성능을 검토하기 위해 과당 생성율을 비교해본 결과, 대등한 조건 하에서회분식 반응기 및 연속식 관형 반응기는 서로 같았고 연속식 탱크반응기는 이보다 작았다.
마지막으로 산업적인 목적을 위해 일정 포도당 농도 (2.3 M) 하에서 효소 충진량에 따라 이 연속식 관형 반응기의 최적 운전조건이 어떻게 바뀌나 조사하였다.
