The expression vector for streptokinase has been constructed from our previously cloned streptokinase coding gene($\underline{\mbox{skc}}$). Because of its deleterious effect on the host cell growth, the leader sequence of skc was removed and the leader sequence-deleted $\underline{\mbox{skc}}$ was subcloned into the vector pkk223-3, which contains the regulatable $\underline{\mbox{tac}}$ promoter and $\underline{\mbox{rrnB}}$ $T_1T_2$ transcription terminator, with a short synthetic oligonucleotide adapter. When this vector, pKS601, was expressed in $\underline{\mbox{Escherichia}}$ $\underline{\mbox{coli}}$, a 47.4 kD protein was found to be newly accumulated to about 12% of the total cellular proteins and it was identified as the streptokinase by immunoblotting with rabbit anti-streptokinase polyclonal serum. The expressed leader sequence-deleted streptokinase caused no detrimental effect to host cell physiology, which means that the deleterious effect of the wild-type $\underline{\mbox{skc}}$ had caused by its putative leader sequence, and showed no degraded 44 kD streptokinase, which is characteristic feature of streptokinase expressed from wild-type $\underline{\mbox{skc}}$. At 37℃, one-fourth of streptokinase was found in sonication-insoluble pellet, which regarded as inclusion bodies, but at 25℃, nearly all of streptokinase was found in sonication-soluble fraction. But the total activity of expressed streptokinase showed the highest values when cells had cultured and induced at 37℃, The expressed streptokinase was purified to near homogeneity using DEAE-cellulose and Sephadex G-150 column. Its specific activity was 1.3×$10^5$ CLN units/mg protein.
And a series of $\underline{\mbox{E.}}$ $\underline{\mbox{coli}}$-$\underline{\mbox{Bacillus}}$ $\underline{\mbox{subtilis}}$ shuttle vectors was constructed by fusing and manipulating the $\underline{\mbox{Staphylococcus}}$ $\underline{\mbox{aureus}}$ plasmid pUB110 and $\underline{\mbox{E.}}$ $\underline{\mbox{coli}}$ plasmid pBR322. The resultant plasmid pZ119(6976 bp) and pZ124(5097 bp), which conferred kanamycin resistance in both hosts, showed high transformation efficiency and were stably maintained for over 30 generations without selective pressure in both host cells. Especially because it is easily isolated in $\underline{\mbox{E.}}$ $\underline{\mbox{coli}}$ cells as multimeric forms in high proportion, which require to transform the competent $\underline{\mbox{B.}}$ $\underline{\mbox{subtilis}}$ cells, and contains the multiple cloning site of pUC18, pZ124 is very useful for DNA manipulation in $\underline{\mbox{B.}}$ $\underline{\mbox{subtilis}}$. Using this shuttle plasmid, six $\underline{\mbox{aprE}}$-$\underline{\mbox{lacUV5}}$ hybrid promoters which are functional in $\underline{\mbox{B.}}$. $\underline{\mbox{subtilis}}$ was constructed. These hybrid promoters, $\underline{\mbox{sac17}}$, $\underline{\mbox{sac18}}$, $\underline{\mbox{sac19}}$, $\underline{\mbox{sac20}}$, $\underline{\mbox{sac21}}$ and $\underline{\mbox{sac22}}$, contains the -35 region and the upstream sequence of the $\underline{\mbox{aprE}}$ promoter, and the -10 $\underline{\mbox{lacUV5}}$ promoter region of $\underline{\mbox{tac}}$ or $\underline{\mbox{trc}}$ promoters. Numbers in the promoter name represent the spacing between the -35 and -10 promoter region, which differ one by one from 17 to 22 base pairs. When the promoter activity was determined by the chloramphenicol acetyltransferase (CAT) activity expressed by each promoters, these hybrid promoters showed very low promoter activity than the $\underline{\mbox{aprE}}$ promoter in $\underline{\mbox{B.}}$. $\underline{\mbox{subtilis}}$ and among the hybrid promoters $\underline{\mbox{sac19}}$ showed the highest promoter activity, But no significant difference in the expressed CAT activity was observed among hybrid promoters with different spacing. The $\underline{\mbox{sac19}}$ promoter showed the same pattern of CAT expression as $\underline{\mbox{aprE}}$ promoter, which is sporulation specific and initiates after the culture enter the stationary phase.
본 연구에서는 혈전증 치료제로 현재 임상에서 urokinase 및 tissue-type plasminogen activator와 더불어 널리 사용되고 있는 스트렙토키나제의 분리 정제를 용이하게 함과 아울러 그 구조연구를 위한 기초연구로, 이전에 클로닝한 스트렙토키나제 유전자를 대량으로 발현시키는 벡터를 개발하였다. 스트렙토키나제 고유의 leader sequence는 대장균 숙주의 세포 생장에 위해작용이 있음을 발견했기 때문에 제거하였으며, leader가 제거된 스트렙토키나제 유전자 절편을 tac 전사촉진제 및 rrnB $T_1T_2$ 유전자의 전사 종결체가 있는 pKK223-3 발현벡터에 새로이 합성한 oligonucleotide adapter와 함께 subcloning 하였다. 이와같이 하여 새로이 제조된 발현벡터를 pKS601이라 명명하였다. pKS601을 가진 대장균 JM107 균주를 LB 배지에서 대수기 후기까지 배양한 후 IPTG로 발현을 유도했을때, 47.4 kD 크기의 단백질이 새로이 축적되는 것이 관찰되었으며, 항 스트렙토키나제 항체로 Western blotting을 실시한 결과 그 단백질이 바로 스트렙토키나제 임을 알 수 있었다. 총 발현양은 IPTG로 유도한지 4시간후 최고로 높아져 총 세포 단백질의 약 12% 정도를 차지하게 되었다. 고유의 leader sequence가 제거된 스트렙토키나제의 경우 숙주의 세포생장에 위해작용이 없었으며, 스트렙토키나제 발현시 특이하게 나타나는 44 kD 크기의 분해된 스트렙토키나제가 나타나지 않았다. 이것은 고유의 leader sequence에 의해 위해작용이 일어나며, 번역 후 일어나는 스트렙토키나제의 절단현상도 역시 고유의 leader와 밀접한 관련이 있음을 의미한다. 37℃ 배양시 약 1/4 정도의 스트렙토키나제가 세포내에서 inclusion body 형태로 존재하는 것으로 나타났으며, 25℃ 배양시는 거의 모든 스트렙토키나제가 세포내에서 용해성 이었다. 이와같이 하여 대량으로 발현된 스트렙토키나제는 ammonium sulfate 분획, DEAE-cellulose column 및 Sephadex G-150 column chromatography 단계를 통하여, 용이하게 95% 이상 순수한 형태로 분리 할 수 있었다. 분리된 스트렙토키나제의 specific activity는 단백질 1 mg 당 $1.3\times 10^5$ CLN unit이었다.
한편 고초균의 대표적 단백질 분해효소인 서브틸리신 유전자 (aprE) 전사촉진제의 활성을 높이며 아울러 이를 조절이 가능한 형태로 개발하기 위하여, aprE의 전사촉진제와 대장균 lacUV5 전사촉진제의 융합을 시도하였다. 이연구를 위하여 먼저 대장균의 pBR322 플라스미드와 고초균의 pUB110 플라스미드를 융합하여 새로운 셔틀 플라스미드 pZ119 및 pZ124 를 만들었다. 이들은 모두 대장균 및 고초균에서 kanamycin 내성으로 선별 할 수 있었으며, 두 균주에서 매우 안정하게 유지되었다. 특히 pZ124의 경우 pUC18의 multicloning site를 가지고 있으며, pBR322에 있는 유전자 recombination의 hot spot을 제거하였기 때문에 고초균의 competent transformation에 요구되는 플라스미드 multimer의 preparation에 매우 유리하도록 만들어져 있다. 이 플라스미드를 사용하여 고초균에서 작용하는 aprE-lacUV5 융합 전사촉진제를 개발하였다. 이들 융합 전사촉진제는 -35 부위와 -10 부위의 거리가 17 bp 에서 22 bp 까지 한개씩의 nucleotide가 첨가된 6종류로 개발되었으며, 이들은 aprE의 -35 부위와 그 이상의 부분 및 lacUV5의 -10 부위와 그 이하의 부분으로 구성되어 있다. 이들 융합 전사촉진제의 활성을 이들에 의해 발현되는 chloramphenicol acetyltransferase의 활성으로 비교하였을때 aprE 전사촉진제에 비하여 상당히 낮게 나타났다. 융합 전사촉진제 중에서는 -35 부위와 -10 부위의 거리가 19 bp 인 sac19가 가장 높은 활성을 보였으며, 그 발현특성은 sporulation에 의해 특이하게 전사를 시작하는 aprE 전사촉진제와 동일한 양상을 나타내었다.
