The transformation of lactic acid bacteria via electroporation with plasmid DNA and expression of the foreign gene in the new host cells were attempted for the purpose of improving lactic cultures using recombinant DNA methods. $\underline{Lactobacillus}$ $\underline{acidophilus}$ was used as host cells and an endoglucanase gene of $\underline{Bacillus}$ $\underline{subtilis}$ origin was used as a model gene.
$\underline{L}$. $\underline{acidophilus}$ cells were grown in MRS broth and cell suspensions of $2\times 10^8$ to $8\times 10^8$ bacteria per ml were prepared in PEB buffer. Into the cell suspensions plasmids pACM1, pACM2, pBSKTAU, and pCK98 containing the endoglucanase gene were added and electroporation was performed. The cells harvested early in the logarithmic growth stage showed the highest transformation frequency. The frequency of transformation was proportional to the field strength of the electroporation pulse at a capacitance of 25uF. Under the optimal conditions the $\underline{L}$. $\underline{acidophilus}$ cells were transformed with frequency form $10^1$ to $10^4$ transformants per ug of DNA.
The endoglucanase gene of $\underline{B}$. $\underline{subtilis}$ origin expressed well in $\underline{L}$. $\underline{acidophilus}$, and most of the gene product was found in the culture medium. The efficiency of the endoglucanase production by the transformed $\underline{L}$. $\underline{acidophilus}$ cells depended greatly on the choice of the vector plasmids on which the gene to be inserted. Under the same cultural conditions, the $\underline{B}$. $\underline{subtilis}$ endoglucanase gene in $\underline{L}$. $\underline{acidophilus}$ produced more amount of endoglucanase than in $\underline{B}$. $\underline{subtilis}$ RM125, suggesting that lactic acid bacteria are good candidates for mass production of endoglucanase. The endoglucanase genes contained in pACM1 and pACM2 were found to use their native promoters for expression, because the $\underline{L}$. $\underline{acidophilus}$ transformants containing these plasmids in which the endoglucanase genes are inserted in opposite directions produced the same amount of gene products. When the native promoter was replaced by tac promoter which is a strong promoter developed for use in $\underline{Escherichia}$ $\underline{coli}$, such as in the $\underline{L}$. $\underline{acidophilus}$ transformant harboring pBSKTAU, the gene expressed better and produced the highest amount of endoglucanase among the transformants tested.
The antibiotic resistance markers of the plasmids which have not any origin of replication originated from lactobacilli, were well expressed in $\underline{L}$. $\underline{acidophilus}$. Plasmid pUB110, originally isolated from $\underline{Staphylococcus}$ $\underline{aureus}$, was well replicated and expressed the kanamycin resistance marker also in $\underline{L}$. $\underline{acidophilus}$ as well as in some Gram positive bacteria. The segregational stability of the transforming plasmids in L. acidophilus cells showed a striking contrast from one plasmid to another plasmid. Plasmid pUB110 was very stable, with 0.3% loss of plasmid per generation, whereas plasmid pGK12 was very unstable, with 20% loss of total plasmids during one generation.
유전자 재조합 기술을 사용하여 lactic culture의 균주 개선과 인류 건강 증진에 도움을 줄 수 있는 균주 개발을 목적으로 전기 천공법에 의한 lactobacilli 안으로의 외래 유전자 전이와 lactobacilli 안에서 그 외래 유전자의 발현을 시도하였다. 숙주로서는 Lactobacillus acidophilus를 사용하였고 model gene 으로서는 Bacillus subtilis의 endoglucanase 유전자를 사용하였다.
L. acidophilus 세포들은 MRS 액체 배지에서 배양했으며, PEB를 사용하여 cell suspension을 만들었다. 사용된 플라스미드로는 pAM610, pUB110, pGK12, pACM1, pACM2, pBSKTAU, pCK98이 사용되었으며, 이들 중 pACM1, pACM2, pBSKTAU, pCK98은 endoglucanase 유전자를 지니고 있다. 전기 천공법에 의한 transformation efficiency는 대수기 초기의 세포를 사용했을 때 가장 높았으며, 또 낮은 전압 보다는 높은 전압의 전기장을 사용했을 때 더 높았다.
B. subtilis origin의 endoglucanase 유전자는 L. acidophilus에서 잘 발현이 되었으며, 만들어진 endoglucanase 효소는 배지 안으로 거의 모두 분비되었다. 형질전환된 L. acidophilus 세포에 의해 만들어지는 endoglucanase의 양은 그 유전자 들어 있는 vector plasmid에 크게 영향을 받았다. 같은 세포 농도로 세포들을 키웠을 때, B. subtilis의 endoglucanase 유전자를 갖는 L. acidophilus 세포가 같은 유전자를 갖는 B. subtilis RM125 보다 더 많은 양의 효소를 생산했는데, L. acidophilus가 이 효소의 대량 생산에 쓰일 수 있다는 가능성을 제시한 것이다. 또한 pACM1과 pACM2에는 endoglucanase 유전자가 반대 방향으로 위치해 있는데, 이들 플라스미드를 갖는 L. acidophilus 세포들이 같은 양의 endoglucanase를 생산했다. 이것은 그 플라스미드 본래의 promoter가 L. acidophilus에서 기능을 발휘하고 있는 것을 보여주며, 특히 E. coli에서 강한 promoter로서 알려진 tac promoter를 endoglucanase 유전자 앞에 갖고있는 pBSKTAU 플라스미드로 형질전환된 transformants가 가장 많은 효소를 만들었는데, L. acidophilus에서 tac promoter의 이용 가능성도 확인할 수 있었다.
형질전환에 사용된 플라스미드들은 어떤 lactobacilli로 부터의 replication origin도 갖지 않았지만 항생제 내성을 잘 발현 했으며, pUB110 플라스미드는 다른 Gram-positive bacteria에서와 마찬가지로 L. acidophilus에서도 Kanamycin 내성을 잘 발현했다.
L. acidophilus 내에 들어간 플라스미드들은 그 세포내에서 안정성이 플라스미드에따라 큰 차이를 보였으며, pUB110은 매우 안정하여 1세대당 0.3%의 플라스미드 상실을 보였으나, pGK12는 1세대당 20%의 상실율을 보여 매우 불안정함을 보여 주었다.
